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乳化异氟醸静脉麻醉的安全性研究

发布时间:2023-03-29 16:35
1前言
1.1麻醉概述
麻醉是指用物理或化学的方法,使整个机体或机体的局部暂时痛觉消失或迟钝,多用于 手术或某些疼痛治疗,这一过程是可逆的,当解除麻醉操作或药物在体内被拮抗、代谢或排 除后,机体便可复苏。随着外科手术及麻醉学的发展,麻醉已远远超过单纯解决手术止痛的 问题,工作范围也不限于手术室,因而麻醉的定义有了更深远的含义。它涵盖了原有的镇痛 概念,而且还涉及到麻醉前和麻醉后整个围手术期过程,对重要的生理功能变化的监测,维 持麻醉期机体内环境的稳态和生理功能,一旦发生麻醉意外可以及时采取有效措施进行抢救
[1]。
19世纪以前属于古代麻醉发展阶段,那时解决手术疼痛的办法包括低温、转移注意力、 放血、休克、过量饮酒、阻断神经和针灸等[2]。这一阶段的特点是人类在经历伤病及手术所 致的痛苦过程中,试图寻找缓解疼痛的手段,但是无论是镇痛效果还是麻醉可靠性,与现代 应用的药物和方法不能相提并论,尚处于萌芽阶段。Morton于1846年10月16日成功地使用乙 醚为患者切除了一个下颌包块,这一事件标志着近代麻醉史的开始[3]。近代麻醉学发展的特 点是医学家、化学家和外科医生为麻醉药的发现和临床应用做出了巨大的贡献,麻醉方法和 药物在临床的应用呈现多样化趋势[4]。从20世纪50年代以后,在临床麻醉学的基础上,麻醉 的范围和领域进一步扩展,麻醉学的基础理论不断取得进步,技术手段不断完善,麻醉学进 入了现代发展阶段。此阶段的特点是出现了专业麻醉人员,诞生了一批新理论、新知识、新 技术。近十几年来,世界麻醉学研究的进展主要体现在基础理论方面的进步。生理学、药理 学、生物化学和病理生理学等边缘学科的发展极大程度地推动了麻醉学的发展[5],人们已经 开始从亚细胞和分子水平研究麻醉药的作用机理、对组织器官的影响以及麻醉药与免疫系统 的关系。
麻醉按作用范围可以分为全身麻醉和局部麻醉,全身麻醉是利用某些药物对中枢神经系 统产生广泛的抑制作用,从而暂时地使机体的意识、感觉、反射和肌肉张力部分或全部丧失; 局部麻醉是利用某些药物有选择地暂时阻断神经末梢或神经干的冲动传导,从而使其分布或 支配的相应局部组织暂时丧失痛觉[6]。全身麻醉按给药方式不同又可以分为吸入麻醉和非吸 入麻醉。吸入麻醉剂多选用乙醚、安氟醚、氟烷、氧化亚氮等,吸入麻醉的镇痛、肌松作用 较强,有良好的可控性且体内代谢率低对机体的影响较小,但是吸入麻醉的实施必须有完善 的麻醉机配合才能做到安全有效,而且呼出的麻醉气体会对环境造成污染。非吸入麻醉有多 种输入途径,静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、口服及直肠灌注[7]。麻醉剂品种 较多,使用方便而廉价,常用药物为巴比妥类、氯胺酮、水合氯醛、硫酸镁等[8]。非吸入麻 醉操作方法简单,无需特殊的麻醉装置,一般不会出现兴奋期,但这种麻醉不能灵活掌握用 药的剂量、麻醉深度及维持时间,药物代谢过程复杂且受肝肾功能影响[9]。
1.2动物麻醉概述
1.2.1动物麻醉的意义
实验动物是生命科学研究的基础和重要支撑条件。目前实验动物几乎涉及到生命科学领 域的各个环节,科学研究、工业生产、疾病检测和科研成果评定几乎都离不开实验动物,它 们因此被称为“活的仪器”,它们的作用是其它工具和设备无法取代的。在高度发达的现代科 学推动下,实验动物学已迅速发展成为一门新兴的综合学科,其发展水平已经成为衡量一个 国家、一个地区、一个行业,特别是生命科学发展水平的重要参考。在对人的各种生理现象 和病理机制及疾病的研究中,实验动物成为人的替难者,各种疾病如高血压、动脉硬化、心 脏病等的发病、治疗与痊愈的机制,以及人类生理、生化、病理、免疫等各方面的机理,都 经过动物实验加以阐明或证实。
在动物实验中,为了减少实验动物的痛苦和挣扎,使其保持安静便于操作,常对动物进 行必要的麻醉[10]。实验动物麻醉的重要意义在于:(1)使动物保持安静,消除动物因疼痛和惊 恐而出现的挣扎、躁动等不利于手术操作和成功实施的因素;(2)保护实验操作者的安全;(3) 基于人道主义方面的考虑,麻醉是保护动物所必须采取的措施[11]。
1.2.2动物麻醉的研究进展
吸入麻醉是动物麻醉史上最早出现的麻醉方法,1540年人们就已经发现乙醚对家禽的催 眠作用。Hikasa等报道了临床上使用七氟醚和异氟醚麻醉对羊的心肺、血液生化功能产生的 影响[12]。Doherty等对8只比格犬经气管插管用氟烷进行了麻醉,确定了氟烷的MAC[13]。熊惠 军的研究表明,七氟醚、氟烷、异氟醚麻醉后24h,犬血清中的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱 性磷酸酶、血尿素氮、肌酐均无显著升高[14]。王洋等对20头巴马小型猪进行异氟醚吸入麻醉 的研究显示,吸入2%异氟醚时呼气末异氟醚浓度维持在0.8%-1.0%,从麻醉开始到意识消失 的时间是270±45s,从停止吸入到恢复自主呼吸的时间是12±2min,从停止吸入至完全清醒的 时间是16±3min,整个麻醉过程动物生理指标接近正常值,痛觉及各种反射消失,达到外科 手术级,苏醒过程平稳,无呕吐及躁动情况发生,麻醉成功率100%[15]。
在非吸入麻醉方面,早在1665年Christopher和Robert就开始给犬静脉注射阿片酊进行全 身麻醉。1854年常规的全身麻醉开始应用于家畜,这是第一次将全身麻醉应用于兽医临床实 践中[16]。1908年动物临床上将水合氯醛应用于马,20世纪30年代又将巴比妥应用于犬和猫。 隆朋具有镇静、镇痛和肌松的作用,由于其对心血管系统可以产生显著影响,如常见的心率 降低、心动过缓和心律不齐,所以临床上经常和巴比妥类麻醉药或氯胺酮联合使用对犬进行 麻醉。Ledechy等观察Telazol合剂(噻环乙胺与咪唑安定复合)对猫的麻醉效果,注射剂量分别 为10和15mg/kg,麻醉诱导期分别为9.2和5.2min,麻醉期为50.4min,麻醉期间可顺利进行外 科处理[17]。薛纪秀用硫贲妥钠20-25mg/kg对6只健康猕猴麻醉,器官移植手术可以进行顺利, 麻醉过程中猕猴唾液分泌没有犬等动物那么多[18]。Hughes等将咪达唑仑0.2mg/kg与芬太尼 5-10g混合静注用于老年犬、猫的诱导麻醉,取得了良好的效果[19]。周庆国用6只小型犬,以 速眠新肌注诱导麻醉后,再以20mg/kg异丙酚和10mg氯胺酮加入到5%葡萄糖溶液200mL中进 行静脉滴注维持麻醉,可以产生3h以上的理想麻醉效果[20]。Muhammad等研究发现异丙酚 4mg/kg复合氯胺酮4mg/kg静注效果最好,既降低了这两种药物的用量,又避免了呼吸抑制[21]。 高利等对犬静脉注射复合异丙酚制剂的研究结果表明,赛拉唑+强痛宁+氯胺酮+异丙酚的麻 醉效果最好[22]。
为了最大限度地降低麻醉药物毒性和副作用,扩大其安全范围,确保动物麻醉过程的安 全和术后顺利康复,人们将两种或两种以上的全麻药物或麻醉方法同时或先后使用,以期望 达到满意的术中及术后镇痛效果,为外科手术创造良好的条件,这种麻醉技术称为复合麻醉 [23],近年来复合麻醉的研究及应用已成为动物医学领域的主要趋势[24]。
1.2.3小型猪的医学研究价值
猪是生物医学研究中应用最为广泛的非啮齿类大型实验动物之一,同其他实验动物相比 猪和人在解剖学、生理学、疾病发生机理等方面极其相似[25]。在心血管系统、消化系统、生 殖系统、内分泌系统、营养代谢病、皮肤烧伤、牙科、眼科、肿瘤、新药毒理学试验、放射 生物及免疫学研究中猪常被用作实验动物,利用猪进行医学科学研究已十分广泛,几乎涉及 生命科学的各个学科,其在生命科学领域具有其它动物无法代替实用价值[26]。目前人类医学 器官移植的供体极度缺乏,猪与人类的器官具有较大的相似性,既能解决人源器官严重不足、 提供源源不断的供体器官、组织、细胞,又能克服灵长类动物异种带来的伦理、病毒传染病 等问题,所以猪一直是人类异种移植的首选供体和研究开发的热点[27]。转基因猪的研究可以 作为生物反应器生产人类所需的重要蛋白,通过猪细胞人源化改造,用于人类疑难疾病的治 疗,如猪红细胞抗原的化学修饰、猪血红蛋白与血液代用品、猪胚细胞与脑血栓的治疗等。 许多猪源性人用生物制品和功能食品如凝血酶、纤维蛋白原、转移因子、抗人白细胞免疫球 蛋白、凝血因子训、卟啉铁等已经被美国、欧盟、日本等发达国家的食品药品监督管理部门 批准生产,转基因猪皮也即将实现产业化。
实验猪越来越受到生命科学领域的关注,由于普通猪体型大、养殖成本高,实验操作和 术后管理不便,与普通猪相比小型猪具有基因纯度及遗传稳定性高、体型小、饲料消耗低、 易于控制所携带的微生物种类、在研究中生长比较缓慢、操作管理方便等优势,因此成为更 理想的实验动物材料。此外,传统的非啮齿类动物(猴、犬)受到越来越多的伦理关注,小 型猪是替代传统非啮齿类犬和猴的理想动物,将会在未来生物医学研究中发挥日益重要的作 用。
1.3乳化挥发性麻醉药的静脉应用
1.3.1载药脂肪乳的应用现状
脂肪乳是以植物油(主要成分为脂肪酸甘油三脂)、磷脂乳化剂、等渗剂和注射用水制成 的稳定的水包油型(0/W)乳剂[28]。脂肪乳按其临床应用不同可分为两类,即载药脂肪乳和营 养脂肪乳,前者将脂肪乳作为药物的体内运送载体,作为一种药物剂型看待,后者成份中不 含治疗性药物,仅仅作为危重患者的肠外营养支持的常规药品。按其油相中脂肪酸甘油酯的 化学结构分类可分为:(1)长链脂肪乳:14-24个碳的脂肪酸占脂肪酸甘油酯的大部分(LCT);
(2)中长链脂肪乳:6-12个碳的脂肪酸占脂肪酸甘油酯的大部分(MCT);(3)混合脂肪乳: 长链脂肪酸甘油酯与中长链脂肪酸甘油酯的混合物; (4)结构型脂肪乳:人为地将多种脂肪 酸与甘油酯化得到的甘油三酯,单个甘油三酯分子中含有长链脂肪酸和中链脂肪酸。依其植 物油在溶液中的浓度不同分为10%脂肪乳、20%脂肪乳、30%脂肪乳和磷脂减半的10%脂肪乳 [29]。
脂肪乳的应用已经经历了40多年的发展,美国、瑞典、德国、法国和日本已经拥有工业 化批量生产脂肪乳的能力。20世纪80年代后期,国内企业首先从瑞典引进并率先开发了脂肪 乳产品,目前作为临床“肠外营养”被广泛应用。营养型脂肪乳应用于临床已经有半个世纪 的时间了,一直被用作肠外能量补给,目的在于为机体提供必需脂肪酸和能量供应、促进脂 溶性维生素的吸收,显著调控氮平衡,维持组成细胞结构的营养物质和脂肪组织的稳态。近 年来由于其优越性十分显著,如安全性和稳定性好,无静脉刺激性,微粒小而分布均匀,乳 化形成的微粒与乳糜微粒十分类似,容易被机体吸收利用,而且具有一定的靶向性[30]。与用 于营养的补给的非胃肠道给药不同,载药脂肪乳注射液将药物包裹于内相或界面层中,成为 一种新型的药物体内转运载体而被广泛地应用于口服、眼部及鼻腔给药[31]。
目前上市的载药脂肪乳剂型有地西泮、丙泊酚、全氟碳、依托咪酯、前列腺素E1、复合 脂溶性维生素、棕榈酸地塞米松等[32]。其中丙泊酚是一种新型静脉麻醉药,具有起效迅速、 苏醒迅速、麻醉时间短等优点,但是由于其水溶性差、亲脂性强的性质,其注射剂的开发从 一开始就遇到了阻力,后来研发的脂肪乳注射液剂型成功的克服了这一困难,最近已经有学 者对丙泊酚纳米乳的研究进行了报道,有望成为丙泊酚脂肪乳剂型的换代产品[33]。依托咪酯 是一种非巴比妥类麻醉剂,将其与脂肪乳制成新的注射液剂型后,对局部组织的刺激明显减 弱,注射局部疼痛减轻、肌肉震颤等不良反应明显减少。目前该领域较新的研究方向是将挥 发性麻醉剂,如异氟醚等乳化制备成脂肪乳注射液剂型,不仅能够提高麻醉诱导的速度,还 可降低生产费用减少对环境的污染。
作为药物载体的脂肪乳,其研究已经相当深入,制备工艺也已经日趋成熟,科技的进步 让以前油水均难溶的药物有望重现生机,乳化剂表面修饰技术可以使药物体内循环时间延长, 还可以促进靶向给药研究的发展。随着对脂肪乳研究的日趋完善,其应用范围也必然会更加 广泛,这一剂型必将在今后的应用中展现其独特的应用价值[34]。
1.3.2乳化挥发性麻醉药研究进展
挥发性麻醉药作为全身麻醉药用于临床麻醉已有近百年历史,迄今为止仍是临床上最常 用的全身麻醉药物之一。由于易燃易爆和不良反应严重等原因,其中一些药物已逐渐被淘汰, 如氯仿、乙醚、甲氧氟烷、氟烷等,而七氟醚和地氟醚虽然用药安全性较高,麻醉诱导及清 醒也较为迅速,但其价格昂贵,目前在国内临床未能得到广泛应用,异氟醚和安氟醚是现今 我国使用最广泛的两种吸入麻醉剂[35]。挥发性麻醉药共同的理化性质是沸点低、脂溶性 高,临床上一般经吸入途径给药用于全身麻醉。吸入麻醉麻醉效能强和易于控制麻醉深度, 血液中麻醉剂的浓度可以通过调整呼吸频率或者潮气量等方式进行调节,挥发性麻醉剂可以 在短时间内迅速从体内洗出,中枢神经系统的麻醉剂浓度可以通过测定呼气末浓度进行估计, 所以吸入麻醉在临床全身麻醉中有着显而易见的优势。但是吸入给药的一些缺点,如需要成 本昂贵的专用挥发罐、有呼吸道刺激而不便用于麻醉诱导、个别药物遇碱石灰易分解给实际 应用带来了不便和危险,为此人们开始尝试通过非吸入途径使用挥发性麻醉药的方法来克服 这些困难。
挥发性麻醉药非吸入给药方式中最早尝试的是静脉给药,这种麻醉方法弥补了吸入麻醉 与静脉麻醉各自的不足,具有全新的优势:(1)不需要挥发罐,降低了麻醉费用;(2)避 免了麻醉药经肺摄取,诱导迅速;(3)麻醉药仍经肺排出体外,可以通过测量呼吸末气体 浓度监测血中麻醉药浓度[36]。挥发性麻醉药静脉给药的最大问题就是其脂溶性很高,难以 配制成普通水溶液使用。研究表明不经载体溶解稀释,直接静脉注射液态的挥发性麻醉药可 导致严重的组织病变,例如静脉血栓、静脉炎症、肺毛细血管病变、肺水肿和肺出血等并发 症,严重的甚至能引起死亡。因而静脉直接应用纯液态的挥发性麻醉药十分危险,要想达到 静脉用药的目的,必须改变该类药物的制剂形式,考虑到挥发性麻醉药具有很高的亲脂性, KrantZ等于上世纪60年代将甲氧氟烷溶解于甘油一酯、甘油二酯和葡萄糖的混合液中,并通 过静脉应用于猴、犬、兔等动物的麻醉实验,结果显示该混合制剂的全身麻醉效果良好,而 且对重要脏器的功能不产生明显损害[37]。静脉用载药脂肪乳剂的出现和发展为挥发性麻醉药 提供了良好的载体媒介,而且它还具有明显的组织器官保护功能。Biber等首先将氟烷溶于脂 肪乳,并发现其静脉注射能够用于实验动物麻醉。1999年Musser等对猪静脉使用5%氟烷脂肪 乳制剂的研究表明,与吸入氟烷麻醉相比,静脉用药除了轻微抑制心血管功能外,未发现其 它并发症[38]。1995年Eger等用脂肪乳剂将异氟醚乳化,发现这种乳化异氟醚制剂静脉注射对 于小鼠的治疗指数是3.2[39]。
目前乳化挥发性麻醉药的研究主要集中在乳化异氟醚上。梁小民的研究结果表明, 6-9% 的乳化异氟醚制剂的性质稳定,异氟醚微粒分布均匀,未见大于1.5从m的乳滴,微粒直径和 乳剂pH值符合2000年版中国药典对静脉脂肪乳制剂的要求,随后又筛选出了兔乳化异氟醚静 脉连续给药的最佳浓度为7%,不同浓度的乳化异氟醚静脉麻醉作用无明显差异,但7%乳化 异氟醚静脉用药无脏器损伤,随着浓度增加组织损伤随之变得严重[40]。刘进等将30%的脂肪 乳剂与异氟醚混匀,制成低于饱和浓度的3.1%和6%乳化异氟醚,其对大鼠的治疗指数为3.2, 与Eger的研究结果相似[41],其随后的动物实验表明,乳化异氟醚对心肌、肝脏和肺局部组织 缺血有保护作用[42]。柴云飞等将40只兔随机分为4个组,对每组进行硬膜外注射,分别注射 8%的乳化异氟醚、1%的利多卡因、30%的脂肪乳,生理盐水作为阴性对照,对动物的感觉功 能、运动功能和意识的变化进行观察,结果表明乳化异氟醚的硬膜外麻醉作用十分显著[43]。 马汉祥等对大鼠静脉注射乳化异氟醚的研究表明,大鼠静脉注射乳化异氟醚的ED50、LD5°和 TI分别是69mg/kg,184mg/kg和2.66,麻醉起效和作用消失时间均比异丙酚短,原因是乳化异 氟醚进入血液后,迅速到达作用部位而产生麻醉作用,当血液流经肺泡时异氟醚又迅速经呼 吸道排出体外屮]。杨小霖的研究结果表明,犬静脉注射乳化异氟醚的MAC明显小于异氟醚吸 入麻醉时的MAC,单次和持续给药的最佳房室模型均为二室模型,提示乳化异氟醚进入体内 后分布仍与吸入时相同,首先快速分布于血流丰富的中央室,然后再从中央室分布到血流较 少的外周室[45]。
张文胜等将12只犬随机分成乳化异氟醚静脉麻醉组和异氟醚吸入麻醉组,在停药至呼气 末异氟醚浓度为零之间测定动、静脉血中异氟醚浓度,结果表明乳化异氟醚静脉麻醉时,输 入量对异氟醚血/气分配系数有明显影响,但与吸入异氟醚相比,异氟醚从血中的洗出时间没 有变化[46]。杨经文采用等辐射分析法和代数分析法对咪唑安定联合乳化异氟醚用药进行分 析,结果表明乳化异氟醚和咪唑安定同时使用能产生协同麻醉效应[47]。饶艳等对犬的研究表 明,与给药前相比,静脉注射乳化异氟醚后1、2、3d尿胆红素、尿潜血和尿胆原水平无显著 差异,表明乳化异氟醚不会引起血管内溶血[48]。彭晶等评价乳化异氟醚对大鼠认知功能影响 的实验表明,乳化异氟醚可导致大鼠一过性认知功能障碍,其机制与下调海马脑源性神经营 养因子(BDNF)表达有关,与皮质醇和神经生长因子(NGF)无关,推测BDNF表达下调与 异氟醚的毒性作用有关[49]。
我国现已成功地筛选出静脉应用乳化异氟醚的配方,即以30%脂肪乳为载体,将液态异 氟醚配制成每毫升含异氟醚120mg的20mL安瓶瓶装制剂,并已获得国家发明专利,目前该药 的临床前实验研究已基本完成[50]。
1.4药物安全性评价
安全、有效和可控是对药物的三个基本要求,无论是对研发者还是监管者来说,药物的 安全性是需要放在首位考虑的问题,是否安全是决定新药研发成功与否的决定因素[51], FDA 数据显示约有30%的新药因安全问题而最终使研发未能成功[52]。如果能在研发初期发现药物 不良反应,筛选并淘汰不具备开发前景的药物,就有可能为挽回不必要的经济损失。过去, 药物毒理学家不参与药物的早期研发,只在药物开发的后期参与到临床的临床前毒性试验中 来,没有积极主动的在早期对新药的开发提供技术支持,致使许多最初被认为有光明开发前 景的药物由于毒性或其它安全性问题而未能面世,即便最后经过分子修饰最终面世,也无法 挽回地造成了人力和财力资源的不必要浪费,使药物研发周期人为地延长。所以,应该在新 药研发的开始阶段即对其进行毒理学与药理学相结合的筛选和优化,这种模式的核心原则是 将药物毒理学研究贯穿于新药发现阶段、临床前安全性评价和上市后监督与跟踪的整个过程 中,它的首要特征是重视发现毒理学在新药开发中的作用[53]。
药物毒理学是研究药物在一定条件下对生物体的损害作用,并对药物毒性作用进行定性、 定量评价以及对靶器官毒性作用机制进行研究的一门科学,药物毒性数据是评价药物安全性 的唯一依据。药物毒理学的研究内容包括单次给药毒性、反复给药毒性、局部毒性、生殖毒 性、遗传毒性、药物依赖性试验、免疫原性、P450的诱导和抑制等。此外,在剂量足够大时, 几乎所有药物都会产生特殊毒性,例如损害肝、肾等器官或影响某一特殊酶的活性而导致中 毒,因此药物毒理学还要研究药物的特殊毒性作用[54]。
1.4.1药物的肝毒性评价
肝脏是药物代谢的主要器官,药物等外源性物质的代谢有时可能使肝脏成为被毒害的靶 器官。根据病因学分类可以将肝脏毒物分成真性毒物和体质依赖性毒物两类。真性毒物的损 害是由药物或其代谢产物引起的,是其药理作用的延伸,这种损伤发生率高、潜伏期短、有 剂量依赖性,相同的损伤可以在实验动物上复制;体质依赖性毒物的毒性主要取决于机体的 功能和状态,主要症状为胆汁郁积,发生率低、潜伏期长短不一、与剂量无关、不易复制。 真性肝毒物根据其作用机制可分为直接损伤和间接损伤。直接毒物能直接损伤肝细胞膜和细 胞器,如四氯化碳可使肝细胞发生脂质过氧化,破坏细胞结构,最终导致肝细胞坏死;间接 毒物产生损伤作用时首先干扰某些代谢途径,引起细胞代谢紊乱,最终导致细胞坏死,如乙 硫氨酸可以使脂蛋白的合成减少,抑制甘油三酯从肝细胞释放,最终导致肝细胞脂肪变性。 但是这两种作用也不能截然分开,如直接毒物四氯化碳可以直接通过脂质过氧化破坏细胞结 构,但它又可以通过自由基引起细胞发生烷基化反应而引起癌症,所以又可看作间接毒物。
1955年Karmen发现在急性肝炎的黄疸前期,血清中谷丙转氨酶(ALT),谷草转氨酶(AST) 活性明显升高,到目前为止,用于肝胆疾病诊断的酶已经多达几十种。ALT在肝细胞中含量 较多,主要存在于细胞液中,当肝细胞损伤时ALT释放到血液中,血清中该酶的活性升高, 在急性炎症中,如急性病毒性炎症、药物中毒性炎症早期,测定ALT常作为判断肝细胞损伤 的灵敏指标。AST存在胞浆AST和线粒体AST两种同工酶,肝细胞损伤早期以胞浆AST释放为 主,当细胞坏死或线粒体被破坏时以线粒体AST释放为主。碱性磷酸酶(ALP)广泛存在于 各个组织器官中,其中肝脏的含量最多,当肝脏发生内、外胆汁淤积时,血清ALP活性会出 现不同程度的升高,肝实质细胞的损伤一般不会影响血清ALP水平。当肝外胆道发生梗阻时, ALP升高幅度可达正常水平的10倍,升高程度和梗阻的程度成正比;肝内胆道梗阻时,血清 ALP 一般表现为中度升高。
1.4.2药物的肾毒性评价
肾脏之所以会成为药物毒性的重要靶器官之一,是由它的解剖结构和生理功能特点决定 的。肾脏的血流量非常丰富,任何外源性物质都可以快速、大量地到达肾脏;肾小管中的物 质会随着尿液的浓缩由无害浓度达到有害浓度;肾脏可以对部分外源化合物进行生物转化, 转化过程中会产生与肝脏相似的毒性作用;药物可以通过改变肾脏的血液灌流间接影响肾功 能;肾脏内部血管表面积大,免疫复合物容易附着。药物最常引起的肾脏损害是急性肾小管 坏死,因为肾小管有重吸收和分泌的功能,该部位药物浓度较高,此外药物还可以引起肾小 球肾炎、间质性肾炎和梗阻性损害。
血中的尿素(BUN)是氨基酸分解代谢的终产物,它不与血浆蛋白结合,主要经肾小球 滤过随尿液排出。BUN的的浓度取决于机体氨基酸的分解速度和肾脏的排泄能力,浓度升高 多出现在较严重的肾小球病变时,降低见于严重的肝脏疾病。血肌酐(CREA)是肌酸代谢 的终产物,在正常生理状态下,CREA浓度主要取决于肾小球的滤过能力,由于肾脏具有较 强的储备能力,70%以上肾单位被破坏时CREA才明显升高,所以CREA水平明显升高时提示 7
肾小球损伤已经十分严重。BUN和CREA联合测定可协助诊断肾性和非肾性肾衰竭,肾性肾 衰竭二者均升高,非肾性BUN升高明显而CREA正常[55]。
1.4.3药物的急性毒性评价
急性毒性是指一次性大剂量接触某种药物后,产生的快速而剧烈的中毒反应,包括死亡 反应。为观察这种毒性作用而设计的试验被称为急性毒性试验,通过这项试验可以测定药物 的半数致死量(LD50)和其它参数,初步估计药物的毒性强弱,还可以通过急性中毒时的症 状表现,推测毒性的靶器官。急性毒性试验是药物安全性评价的第一道关卡,是新药必须要 进行的试验项目之一。LD5°的数值能够反映药物毒性大小,但在评价一种药物的价值时毒性 的大小必需与药效结合在一起考虑才能判断药物是否安全。因为一个毒性很小的药如果药效 也极低,就不可能应用到临床,相反即使一种药物虽有一定的毒性,但疗效极好,用较小的 剂量即可出现明显效果,而且这个剂量对机体并不产生毒性,则这个药物仍不失为一种有价 值的药物,评论药物毒性与药效的关系用治疗指数(TI)表示TI=LD50/ED50, TI数值越大药物的 安全性越高。
1.5实验的目的和意义
无论是作为探讨人类疾病发生和防治的活的精密仪器,还是用于动物本身的疾病治疗、 运输,麻醉作为保证手术操作成功实施及完成科研项目全过程数据收集的关键环节,都是手 术及科研项目研究过程中必不可少的重要步骤。乳化挥发性全麻药兼具吸入麻醉和静脉麻醉 的优点,研究结果已经显示出它们今后可能发挥的巨大临床价值。目前乳化挥发性麻醉药的 研究主要集中在乳化异氟醚上,已经证实乳化异氟醚静脉麻醉可产生确切的可逆性的麻醉作 用,但所有研究还停留在动物试验阶段,要把它应用于临床还有待于进一步的研究,所以建 立它的基础数据库显得十分有必要[56]。
氧化应激是机体的一种基本病理过程,表现为体内氧化与抗氧化作用失衡,倾向于氧化, 导致中性粒细胞炎性浸润,蛋白酶分泌增加,产生大量氧化中间产物,氧化应激被认为是导 致衰老和疾病的一个重要原因,几乎和所用的常见疾病都有关系[57]。肝脏与肾脏是药物在体 内最重要的代谢和排泄器官,如果药物对肝脏和肾脏的功能产生影响,必然会改变药物在体 内的分布,进而改变药物的疗效,甚至发生中毒的情况[58]。药物进入体内后,主要在肝细胞 线粒体细胞色素P450的作用下进行代谢,经肾脏或肠道排出体外,药物可以在代谢过程中直 接影响肝脏的功能,也可以通过影响肝脏血液灌注间接影响肝脏功能[59]。麻醉药对肾功能的 抑制主要是对交感神经和循环、内分泌系统的间接作用和对肾小管转运的直接作用。
30%静脉脂肪乳和异氟醚均为2000年版药典中的药物,乳化异氟醚是这两种药物混合溶 解后的新型制剂,目前尚无证据证明二者混合后不会对机体产生不良反应,所以有必要对其 进行安全性试验。本研究的目的是,探讨单次静脉应用乳化异氟醚麻醉是否会对小型猪抗氧 化能力和肝肾功能产生影响,并测定尾静脉注射时对小鼠的治疗指数(TI),判断其静脉应用 的安全性,旨在探索一种新的小型猪麻醉方法,同时为该药进入临床试验提供重要参考依据。
2材料与方法
2.1实验材料
2.1.1实验动物
巴马小型猪10头,6-8月龄,雌雄各半,体重22.5±4.5kg,临床检查健康,同一条件下饲 养3周后进行实验,实验前禁食12h,不禁水。4-5周龄昆明小鼠100只,雌雄各半,体重24.5±2.2g, 喂养3天以适应实验条件,实验前禁食12h,不禁水。
2.1.2实验仪器
(1)Datex-OhmedaS/5TM 型重症监护仪(芬兰 Datex-Ohmeda 公司)
( 2) Inte11iVue MP20 监护仪(荷兰 Phi1ips 公司)
(3) 微量注射器(日本JMS公司)
(4) EPOCH酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)
(5) 高速冷冻离心机(德国sigma公司)
(6) SYNCHRON CX4 PRO全自动生化分析系统(美国贝克曼公司)
(7) 微量移液器(芬兰勃雷公司)
( 8 ) 50 微升微量进样器(上海佳安分析仪器厂)
(9) XW-80A漩涡振荡器(上海医科大学仪器厂)
(10) JD500-2型电子天平(沈阳龙腾电子仪器有限公司)、采血管、注射器等。
2.1.3实验药品和试剂
2.1.3.1实验药品
(1) 氯胺酮注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司,批号:20120314)
(2) 隆朋注射液(原粉自行配制)
(3) 30%脂肪乳注射液(华瑞制药有限公司,批号:20120116)
(4) 异氟醚(河北九派制药股份有限公司,批号:20120309)。
2.1.3.2实验试剂
(1) 丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒(ALT)
(2) 天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒(AST)
(3) 碱性磷酸酶检测试剂盒(ALP)
(4) 肌酐检测试剂盒(CREA)
(5)血尿素氮检测试剂盒(BUN)
(6)甘油三酯检测试剂盒(TG)、
(7)总抗氧化能力检测试剂盒(T-AOC)
(8)谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒(GSH-Px)
(9)超氧化物歧化酶检测试剂盒(SOD)
(10)丙二醛含量检测试剂盒(MDA) 所有试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
2.2 实验方法
2.2.1乳化异氟醚麻醉对小型猪血清氧化应激指标和肝肾功能影 响
2.2.1.1 乳化异氟醚的配制
用“玻璃瓶法”配制容积浓度7%的乳化异氟醚。抽取18.6mL 30%脂肪乳置于玻璃瓶中, 将橡胶瓶盖旋紧,并插入两只7号针头,一只插入脂肪乳液面以下,另一针头位于玻璃瓶剩余 的少量空气中。以微量进样器准确地经插入液面的针头迅速将1.4mL液态异氟醚加入瓶中并 拔出两针头。手持玻璃瓶在漩涡振荡器上剧烈震荡大约1 min,直到无液态异氟醚的小液滴为 止。
2.2.1.2实验动物的麻醉和血样采集
小型猪实验前禁食12h,不限制饮水。将猪仰卧固定在保定台上,在耳缘静脉用氯胺酮和 隆朋复合进行基础麻醉,麻醉后立即以7%乳化异氟醚1.6mL/kg/h耳缘静脉输液维持麻醉。小 型猪耳缘静脉注射方法:先用剪刀清除耳朵表面被毛,再用纱布反复擦拭耳朵表面皮肤充盈 血管,然后用75%酒精由内向外消毒采血部位,待酒精完全干燥后再进行穿刺,最后用胶布 固定针头。
连接监护仪对呼吸、心率、体温、血氧饱和度和无创血压进行监测,麻醉80min后停止 输液。分别于麻醉前和麻醉后 10min、20min、30min、45min、60min、80min、2h、6h、1d、 2d、3d采集前腔静脉血样,采血位置为胸骨前端左或右侧与第一肋骨、气管围成的三角区, 先用75%酒精由内向外消毒采血部位,然后在前腔窝处垂直进针约4cm-5cm,针头进入前腔 静脉时血液会自动涌入针管,采血后以灭菌纱布用力抵住采血部位止血。采集的样品静置 20min后放入高速冷冻离心机在4°C条件下3000rpm离心10min,分离血清至EP管,标记后放入 冰箱-25 C冷冻保存待检。
2.2.1.3血清样品氧化应激指标检测
血清谷胱甘肽过氧化物酶、丙二醛、超氧化物歧化酶、总抗氧化能力均采用双抗体一步 夹心ELISA法检测,按试剂盒说明书进行加样,用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD 值),在EXCEL工作表中绘制出标准品线性回归曲线,按曲线方程计算样品浓度。
2.2.1.4肝肾功能检测
样品均采用CX4 PRO全自动生化分析系统进行检测,按说明书设置生化分析仪的各项 参数并进行加样,根据公式AA/分xF计算样品浓度。碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、 血尿素氮、肌酐均采用速率法检测,甘油三酯采用酶比色法检测。
2.2.2小鼠尾静脉注射乳化异氟醚的LD50和ED50测定
2.2.2.1 乳化异氟醚的配制
用上述玻璃瓶法配制容积浓度 0.5%-0.9%的乳化异氟醚,组间浓度公比为 1:0.86,用于 测定小鼠尾静脉注射的ED50;配制容积浓度0.9%-1.4%的乳化异氟醚,组间浓度公比为1:0.89, 用于测定小鼠尾静脉注射的 LD50。
2.2.2.2小鼠尾静脉注射乳化异氟醚的ED50测定
小鼠在实验条件下喂养3d以适应实验条件,实验室温度20°C左右,相对湿度30%-70%, 自然光照明,噪音不高于65分贝。保持笼具卫生,勤换垫料,保持空气流通。所有实验都在 下午2点到5点之间进行,以减少生物节律的不同对实验结果的干扰。
通过预实验获得尾静脉注射乳化异氟醚时小鼠麻醉率为100%的最小剂量和麻醉率为0% 的最大剂量,在此剂量范围内按等比数列分为5个剂量组。正式试验时将50只小鼠雌雄分别 称重后编号,随机分配到各剂量组,每组10只,雌雄各半。按等容量不等浓度的原则,每只 小鼠不同浓度乳化异氟醚的等容注射量为0.014mL/g,确保每只小鼠注射剂量相同,避免剂 量差别对实验结果产生干扰。
判定麻醉的标准为小鼠翻正反射的消失,翻正反射恢复为麻醉结束的标志。观察小鼠的 麻醉状态,记录每组翻正反射消失小鼠的个数和麻醉小鼠翻正反射恢复时间。
2.2.2.3小鼠尾静脉注射乳化异氟醚的LD50测定
通过预实验获得尾静脉注射乳化异氟醚时小鼠死亡率为100%的最小剂量和死亡率为0% 的最大剂量,在此剂量范围内按等比数列分为5个剂量组。正式试验时将50只小鼠雌雄分别 称重后编号,随机分配到各剂量组,每组10只,雌雄各半。按等容量不等浓度的原则,每只 小鼠不同浓度乳化异氟醚的等容注射量为0.014mL/g,确保每只小鼠注射剂量相同,避免剂 量差别对实验结果产生干扰。观察小鼠的中毒表现,记录每组死亡小鼠的个数,观察时间为 10min。
2.3数据整理与统计分析
数据以均数土标准差(X土SD)表示,P<0.05为差异显著,P<0.01为差异极显著。用 Microsoft Excel 2003软件对实验数据进行整理,在PASW 18.0数据统计分析软件中进行单因 素重复测量数据的方差分析和图形制作,在PASW 18.0数据统计分析软件中用概率单位加权 回归法(bliss法)计算LD50和ED50。
3实验结果
3.1小型猪乳化异氟醚静脉麻醉的效果
诱导药物注射后小型猪翻正反射立即消失,诱导迅速,无诱导期兴奋现象,所有动物皆 未出现呕吐、流涎等不良反应;麻醉开始10mm后,小型猪生理指标开始趋于稳定,麻醉过 程中小型猪对声音、针刺、钳夹等伤害性刺激无反应,表现出较好的镇痛效果,四肢、腹壁 肌肉松弛,肌松效果良好;呼吸、心律、血氧饱和度、可视黏膜等生命体征基本正常,个别 动物在麻醉过程中出现了呼吸抑制,表现为呼吸浅表、变慢甚至出现呼吸暂停的情况,这种 情况在减少乳化异氟醚输入量后恢复正常;停止输液10min左右动物出现体动,翻正反射随 后恢复,自主站立并可自由行走,苏醒过程平稳,无呕吐及躁动情况发生。
3.2乳化异氟醚麻醉对小型猪氧化应激指标的影响
在乳化异氟醚维持麻醉的过程中,小型猪各项氧化应激指标都出现了波动,但每项指标 在各个时间点差异不显著(P>0.05),具体结果见表3-1。
表3-1乳化异氟醚麻醉对小型猪氧化应激指标的影响(n=10, X±SD)
Tab. 3-1 effect of mulsified isoflurane anesthesia on miniature pigs oxidative stress indicators (n =10, X士SD)
时间 GSH-Px MDA SOD T-AOC
(min) (U/mL) (nmol/mL) (U/mL) (U/mL)
0 30.09士6.68 6.11士2.98 59.17士12.45 7.26士1.89
10 26.79士6.61 5.67士3.03 62.79士13.65 6.74士2.68
20 27.74士5.78 4.21士1.77 61.64士15.89 6.29士1.91
30 24.53士4.51 5.31士1.25 60.50士16.16 6.19士1.25
45 26.71士5.73 5.65士1.72 66.43士16.58 7.76士2.75
60 27.77士6.77 5.12士1.56 67.12士17.07 8.08士2.08
80 30.72士6.15 4.37士1.59 65.13士14.37 6.66士2.05
表中各氧化应激指标在不同时间点差异不显著。
血清中GSH-Px活力在麻醉开始后呈下降趋势,30min时降到最小值,此后一直上升,到 80min时基本恢复到麻醉前的水平(图3-1)。
 
 
血清中MDA含量在麻醉开始后呈下降趋势,20min时降到最小值,此后经历了一个上升 又下降的波动过程,整个麻醉过程中MDA含量始终低于麻醉前(图3-2)。
 
 
麻醉开始后,血清中SOD活力经历了两次波动,在整个麻醉过程中,SOD活力始终高于 麻醉前(图3-3)。
 
 
T-AOC活力在麻醉开始后先下降,30min时降到最小值,随后开始上升,在60min时上升 到最大值并超过麻醉前水平,此后又开始下降,到在80min时低于麻醉前水平(图3-4)。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5-
l l l l l l i
Omin 10min 20min 30min 4Smin 6Omin 80min
BJfSJ
图3-4乳化异氟醚麻醉对小型猪血清T-AOC活力的影响
Fig.3-4 effect of mulsified isoflurane anesthesia on miniature pigs T-AOC
 
3.3乳化异氟醚麻醉对小型猪肝肾功能的影响
在乳化异氟醚维持麻醉的过程中,小型猪肝肾功能各项指标都出现了波动,但除TG夕卜, 其它各项指标在不同时间点的差异不显著(P>0.05 ), TG在不同时间点的差异极显著 (P<0.01),具体结果见表3-2。
表3-2乳化异氟醚麻醉对小型猪肝肾功能的影响(n=10, X±SD)
Tab. 3-2 effect of mulsified isoflurane anesthesia on miniature pigs liver and kidney function( n = 10, X±SD)
时间 ALP ALT AST BUN CREA TG
( min) (U/L) (U/L) (U/L) (mmol/L) (umol/L) (mmol/L)
0min 85.17±18.76 45.83±8.30 58.33±13.76 4.02±2.51 83.33±16.21 1.03±0.63
2h 91.00±21.30 46.17±7.47 60.83±12.90 3.65±1.54 84.33±13.19 1.64±0.75
6h 92.17±18.18 49.17±5.71 72.33±9.46 4.42±0.60 84.17±15.16 0.47±0.29
1d 85.83±14.31 52.17±5.78 54.83±7.03 4.35±2.92 71.50±3.56 0.86±0.38
2d 84.83±12.18 50.33±7.42 48.83±10.34 5.85±5.10 77.33±6.80 0.86±0.36
3d 84.17±10.83 51.17±10.57 57.83±17.57 5.62±2.80 86.33±14.84 0.85±0.30
表中各项指标中,血清TG含量在不同时间点差异极显著(P<0.01),其它各项指标在不同时
 
间点差异不显著。
在麻醉开始后,血清ALP活力一直上升,在6h时达到峰值,此后开始下降,在第3d时基 本恢复到麻醉前水平。(图3-5)。
 
 
 
 
 
麻醉开始后,血清AST活力持续上升,到6h时达到峰值,此后一直下降,到第3d时恢复 到麻醉前水平(图3-7);
 
 
麻醉开始后血清BUN含量稍有下降,2h后开始上升并超过麻醉前水平,
于麻醉前水平(图3-8);
 
 
 
图3-8乳化异氟醚麻醉对小型猪血清BUN水平的影响
Fig.3-8 effect of mulsified isoflurane anesthesia on miniature pigs BUN
血清CREA含量在麻醉开始后的5h内没有明显变化,从第6h开始下降,在1d时降到最低, 此后开始持续上升,在第3天时基本恢复到麻醉前水平(图3-9);
 
 
 
图3-9乳化异氟醚麻醉对小型猪血清CREA水平的影响
Fig.3-9 effect of mulsified isoflurane anesthesia on miniature pigs
血清TG含量在麻醉开始后持续上升,在2h时达到峰值,从2h后开始下降,6h时降到了最 低水平,此后TG含量开始升高,在Id时基本恢复到了麻醉前的水平并保持稳定(图3-10)。
 
 
图3-10乳化异氟醚麻醉对小型猪血清TG水平的影响
Fig.3-10 effect of mulsified isoflurane anesthesia on miniature pigs TG
3.4小鼠尾静脉注射乳化异氟醚的ED50、LD50和治疗指数TI
3.4.1小鼠ED50实验结果
静脉注射乳化异氟醚后,所有麻醉小鼠的翻正反射均在2s内消失,恢复时间为37±30s, 详细数据见表 3-3。高剂量组个别小鼠麻醉后的最初几秒出现短暂的呼吸停止,但自主呼吸 很快恢复,整个实验过程中无小鼠死亡。根据实验数据,在PASW 18.0中利用概率单位加权 回归法(bliss法)计算结果,乳化异氟醚对小鼠ED50相当于其中液态异氟醚83^L/kgo实 验详细数据见表3-4。
表3-3 ED5 0组不同剂量间麻醉时间比较
Tab. 3-3 anesthetic time of different doses
异氟醚剂量
gL/kg) 麻醉只数 平均麻醉时 间⑸ 最长麻醉时
间(s) 最短麻醉时
间(s)
70 0 - - -
81 7 32 75 13
94 8 26 72 7
109 8 41 93 7
126 10 46 156 13
 
 
表3-4 ED5 0实验数据
Tab. 3-4 experimental data of ED50
组别 异氟醚剂量
gL/kg) 实验动物数 麻醉动物数 有效率(%)
1 70 10 0 0
2 81 10 7 70
3 94 10 8 80
4 109 10 8 80
5 126 10 10 100
 
3.4.2小鼠LD50实验结果
实验中所有小鼠在注射乳化异氟醚后,都出现呼吸停止,存活小鼠在停止一段时间后重 新恢复自主呼吸。所有死亡小鼠始终没有恢复自主呼吸,发生抽搐后死亡,抽搐同时伴有尿 失禁发生。根据实验数据,在PASW 18.0中利用概率单位加权回归法(bliss法)计算结果, 乳化异氟醚对小鼠LD50相当于其中液态异氟醚167^L/kg。实验详细数据见表3-5。
表3-5 LD50实验数据
Tab. 3-5 experimental data of LD50
组别 异氟醚剂量
gL/kg) 实验动物数 死亡动物数 死亡率(%)
1 126 10 0 0
2 141 10 1 10
3 157 10 3 30
4 176 10 6 60
5 196 10 10 100
 
3.4.3小鼠乳化异氟醚静脉麻醉的治疗指数(TI)
根据公式TI=LD50/ED50,计算得到小鼠乳化异氟醚静脉麻醉的治疗指数为2。
4讨论
有研究表明,异氟醚在30%脂肪乳中饱和的最大浓度为8.4%,异氟醚的浓度不高于8.4% 时溶液中不会存在游离的液态异氟醚,此时其静脉用药是安全的[60]。本实验所用的乳化异氟 醚远低于此浓度,可以确保异氟醚充分溶解在脂肪乳中,不存在析出状态的异氟醚。
本实验血液样本的采集部位在猪的前腔静脉,前腔静脉采血虽然难度较大,但只要技术
熟练,采血省时、省力而且量多,所以是猪常用的采血方法[61]。采血操作时要注意不同年龄、 不同体重猪的皮肤和脂肪厚度差别较大,体重小的猪进针要浅,体重大的猪进针应稍深,还 应该注意这种深部的大静脉在采血后止血效果难以确定,采血不当时会造成局部大出血甚至 动物的死亡,每次采血后都要进行长时间按压止血[62]。
溶血是血液中的红细胞破裂,细胞内成分进入血清后,使血清呈现出红色的一种现象[63]。 采血过程中由于注射器难以控制压力,易形成冲击和湍流而机械性导致红细胞破裂,或注入 试管时产生气泡,表面张力下降导致溶血,另外操作者晃动试管时用力过猛也会造成溶血[64]。 血液样本溶血后会导致检验结果不准确,对绝大多数酶类物质干扰较大,不能客观真实的反 应身体状况。溶血导致临床生化检验结果与实际不一致的原因有以下几个方面:(1)红细胞 中存在钾离子、血红蛋白、AST、LDH等细胞成分和各种酶,在发生溶血后会进入到血清, 血清中该物质含量会大幅升高[65]。(2)溶血时红细胞的可溶成分释放到血清当中,血清体积会 出现明显增加,血清中的固有的物质浓度会发生显著下降。(3)红细胞释放的的成分与血清 固有成分发生化学反应[66],另外溶血会严重影响血清吸光度[67]。为尽可能避免溶血的发生, 减小溶血对生化检验结果的影响,在采血的过程中要注意保持注射器、采血管、针头的清洁, 酒精可以导致溶血,因此针头不能使用酒精消毒[68],血液放置时间不宜过长,尽量不要存放 在冰箱和冷冻室内,离心时要控制速度。如果发现血样出现溶血,应重新采样,以确保检验 的准确。本实验的采血过程中严格遵守上述原则进行,没有明显的溶血情况的发生。
4.1 乳化异氟醚的麻醉效果
实验用小型猪常采用肌肉或腹腔内注射的方法进行麻醉,但存在麻醉维持时间不长、麻 醉深度难以掌控等缺陷,还可能引起术中实验动物的疼痛,违反动物福利的相关规定,而用 乳化异氟醚静脉给药的方式则可以灵活的掌控麻醉时间和麻醉深度,加强了麻醉的安全性和 可控性。异氟醚可影响中枢神经系统和神经肌肉接头,具有良好的肌松效应,并且停药后肌 松作用迅速消失。但异氟醚对呼吸有抑制作用,表现为呼吸幅度变小、频率变慢每分通气量 减少,血氧饱和度降低,其原因可能是异氟醚强烈的肌松作用抑制了呼吸肌,或者由于药物 直接抑制呼吸中枢而抑制呼吸。实验中个别动物发生了呼吸抑制的情况,采取的处理方法是 迅速停止输入麻醉药,给动物吸入纯氧并加压辅助呼吸,以此来补充呼吸频率和潮气量,辅 助呼吸应与动物的呼吸频率同步,增加的频率在两次呼吸之间,发生呼吸抑制的动物经抢救 后恢复正常。
冯征等的实验结果表明1.5MAC、2.0MAC剂量异氟醚依赖性的抑制大鼠大脑皮层、小脑、 脑干和海马4个脑区的Na+、K+-ATP酶的活性,从而提示异氟醚可能通过对上述四个脑区的 Na+、K+-ATP酶活性的抑制影响突触传递而发挥麻醉作用[69]。Franks通过异氟醚对离体大鼠 大脑突触体Ca2+-ATP酶活性影响的研究发现,临床浓度的异氟醚对大鼠大脑突触体Ca2+-ATP 酶活性有明显的抑制作用[70]。AC-cAMP-PDE信号系统起着快速跨膜传递信号的作用,是细 胞内重要的信息传递通路,外界刺激通过这一系统调节细胞功能。每一个细胞的细胞膜都存 在G蛋白、受体和腺苷酸环化酶(AC)三种蛋白质,刺激信息到达细胞膜外表面后与兴奋性 或抑制性受体结合,使AC激活或钝化,当AC被激活时,在mg2+参与下ATP被催化生成cAMP 作为第二信使,把各种信息传入细胞内,进而调节细胞的生理功能。胡兴国研究发现异氟醚 
能使大鼠大脑皮层和脑干cAMP的含量升高,认为这可能是其全麻作用的分子学机制之一[71]。
4.2乳化异氟醚麻醉对小型猪氧化应激指标的影响
在正常生理条件下,机体新陈代谢不断地产生自由基,但会被机体的自由基清除系统(抗 氧化系统)及时清除。机体的抗氧化系统由大分子抗氧化酶和小分子的非酶类抗氧化剂组成, 前者的作用是催化抗氧化反应,而后者是抗氧化反应的底物,它们共同承担体液抗氧化作用。 抗氧化酶类主要包括SOD、GSH-Px和CAT等,它们的活力是衡量机体抗氧化能力的重要指 标,T-AOC反应的是机体抗氧化酶的总活力[72]。当机体遭受各种有害刺激时,体内自由基产 生过多,抗氧化系统不能及时清除自由基,就会破坏生物大分子,产生氧化应激,引起细胞 结构和功能的异常[73], MDA 是自由基与不饱和脂肪酸发生反应的产物,其含量可以间接反 映细胞损伤程度[74]。
多种原因可以启动机体的氧化应激反应,导致氧化应激的发生。营养物质的缺乏,如具 有抗氧化作用的维生素,如脂溶性维生素VE、水溶性维生素VC不足,组成抗氧化酶必不可 少的的微量元素Zn (SOD)和Se (GSH-Px)不足;外部环境因素,包括大气污染、强烈的 电磁波、缺氧、药物、有毒的化学物质;过度的体能消耗、创伤、吸烟、喝酒和急慢性感染 也会引起氧化应激。多种原因都能在机体内环境中启动或促进氧化应激反应[75]。
氧化应激前期血清SOD活性是反映应激程度的敏感指标,而血清GSH-Px活性和MDA 含量则是反映氧化应激后期效应的敏感指标。在本实验的麻醉过程中,小型猪血清 SOD、 GSH-Px、T-AOC活性及MDA含量随时间呈现无规则变化,但在各时间点间的差别无显著意 义,表明乳化异氟醚麻醉不会引起小型猪的氧化应激。麻醉过程中MDA含量始终低于麻醉 前水平,这与Shayevitz J报道异氟醚具有抗氧化作用相符[76],异氟醚的抗氧化作用主要与亲 脂性麻醉药的“膜效应”有关,亲脂性麻醉药进入膜后引起膜膨胀,降低了离子通道的稳定 性,影响细胞膜的结构,进而减少中性粒细胞粘附和活化[77]。中性粒细胞活化是氧自由基释 放、蛋白水解酶及炎性介质产生的必要条件,中性粒细胞被激活后,触发细胞膜上的髓过氧 化物酶,产生大量的氧自由基[78]。有研究表明脂肪乳中亚油酸含量过高而抗氧化物质含量过 低,在创伤、感染等高代谢状态时,可影响粒细胞活性,导致机体免疫功能受损,脂质过氧 化增加[79],在本实验中,动物健康状况良好,没有发生上述情况。
本实验比较的是某一指标在不同时间点的变化,看似完全随机实验设计,实则属于单因 素重复测量设计,其特点是不同时间点间的观察是相关的、不独立的,很多数据统计对此都 采用单因素方差分析甚至T检验等错误的方法[80]。单因素重复测量数据不能直接对数据进行 单因素方差分析,而是先要对数据进行球形检验,判定数据间是否存在相关性。如果数据符 合球对称条件,可按单因素方差分析处理,如果数据不符合球对称条件,说明重复数据之间 存在相关性,此时应该采用重复测量方差分析模型[81]。本实验中若干指标的数据经检验不符 合球对称条件,不能直接进行单因素方差分析,要对其进行重复测量方差分析,可以使统计 结果更加准确。
4.3乳化异氟醚麻醉对小型猪肝肾功能的影响
血清酶学检查是目前广泛使用的、较为敏感的肝损伤检查方法,因为肝细胞损伤时,大 量的酶会释放入血,各种血清酶对不同类型的损伤敏感性不同。ALP主要反映胆汁郁积性损 伤,AST、ALT主要反映肝实质细胞损伤,是应用最广泛的酶学指标,其中的AST对急性肝 坏死极其敏感。BUN是蛋白质的正常代谢产物,在毒理学中可以通过测定BUN来衡量肾小 球的滤过功能;CREA是肌酸的代谢产物,经肾小球滤过后,不被肾小管重吸收而全部随尿 排出。当肾功能出现障碍时,血中BUN和CREA水平显著升高。
异氟醚体内生物转化极少,几乎全部以原形从肺呼出,仅0.17%受肝微料体酶催化,最 终的代谢物三氟乙酸和无机氟化物随尿排出[82]o Eger报道即使长时间异氟醚麻醉也不会造成 肝脏损害,各种肝血清酶含量没有明显改变。异氟醚和其它全身麻醉药能减少肾血流、肾小 球滤过率和尿生成,本实验中异氟醚麻醉后未见肾功能损害,肌酐清除率无变化[83]。李亚红 的实验表明静脉输入脂肪乳后肝功能指标ALT、AST和ALP均上升,但均未超出正常值范 围,肾功能指标无明显变化[84],这与脂肪乳本身经肝脏代谢而不经肾脏代谢排泄有关[85],本 实验结果与其相符。
实验结果显示乳化异氟醚静脉麻醉后,小型猪各项肝肾功能指标随时间变化有所波动, 但除TG外其它各项指标在各时间点的变化没有显著意义(P>0.05)。血清TG含量在不同时 间点差异极显著(P<0.01),在麻醉开始后的2h内,血清TG含量持续升高,从第3h开始显 著下降,下降发生在停止注射乳化异氟醚后不久。静脉内输入的脂肪乳剂是很微小的脂肪小 滴,这些小滴的大小与天然乳糜微粒一样,在血液内与天然的乳糜微粒有相同的清除率,它 不会引起甘油三酯的长期积聚[86]。实验中血清TG含量在1d后基本恢复到麻醉前水平,表明 静脉乳化异氟醚麻醉对小型猪的肝肾功能没有显著影响,实验结果与上述文献报道一致。
4.4小鼠尾静脉注射乳化异氟醚的LD50和ED50测定
急性毒性试验是毒理实验的一种,以药物对动物的致死量表示,一个新药经过试验证实 有效后,都必须经过一系列的毒性和药理试验证明是否安全,才能推荐到临床使用[87]。在医 学实验中,常以引起50%实验动物死亡的药物剂量,即LD50来表示药物急性毒性大小。物质 的毒性往往受给予方式的影响,毒物可以经胃肠道、呼吸道、皮肤和注射等方式进入体内, 为了与乳化异氟醚的临床应用给药途径保持一致,本实验采用静脉注射的方法评价乳化异氟 醚的急性毒性。药物毒性与药效的关系用治疗指数(TI)表示,TI=LD50/ED50, TI越大药物 安全性越有保证,一般认为TI大于3的药物才具有实用价值。本实验计算ED50和LD50所用 的Bliss法又称概率单位加权回归法,是目前新药审批办法中推荐使用的方法,在众多的ED50、 LD50的计算方法中最精确[88]。
本实验所用的小鼠都是健康的、体重基本一致的小鼠,而且都是随机分配到各剂量组, 这样可以避免动物的个体差异对实验结果的影响。由于乳化异氟醚是一种新的复方制剂,所 以在进行正式试验前,要先通过预实验确定小鼠 0%和 100%死亡的大致剂量范围。本实验中
所有高剂量麻醉小鼠和死亡小鼠都不同程度的出现了呼吸抑制,提示其急性毒性作用与呼吸 抑制有关,这与刘爱杰等对犬进行的乳化异氟醚急性毒性实验结果一致[89]。如果在乳化异氟 醚麻醉过程中进行通气控制可能会降低动物死亡率,提高药物的安全性。本实验得到的小鼠 乳化异氟醚静脉注射TI为2,这与小鼠异氟醚吸入麻醉的TI 15.3相比安全性很低[90],可能 与吸入麻醉时的通气控制有关。本实验中小鼠被乳化异氟醚麻醉后迅速恢复清醒,与药物在 体内的迅速再分配和通过肺立即消除有关[91]。
5结论
(1)乳化异氟醚静脉注射可以对小型猪产生满意的麻醉效果,麻醉过程中镇痛、肌松效 果良好,苏醒过程快而平稳。
(2)在乳化异氟醚静脉麻醉过程中,小型猪血清氧化应激指标在各个时间点的差别没有 显著意义,其单次应用不会引起小型猪的氧化应激。
(3)在整个测试期间,乳化异氟醚麻醉没有引起小型猪肝肾功能指标的显著变化,其单 次应用对小型猪肝肾功能没有显著影响。
(4)乳化异氟醚静脉注射时可以诱导小鼠产生安全、可逆的全身麻醉,其治疗指数较小, 急性毒性作用主要与呼吸抑制有关,临床应用时可在麻醉过程中配合人工通气来提高安全性。
致 谢
本研究的选题、设计、实施都是在导师王洪斌教授的悉心指导下完成的,王老师严谨的 治学态度和正直的人格魅力将使我受益终身,在此向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢。
整个实验是在胡魁博士的带领下完成的,在实验中与杨同涛和张昊进行了愉快的合作。 感谢外科教研室的刘云教授、高利教授、范宏刚教授、肖建华教授和张建涛老师在实验中给 予的指导和帮助。还要感谢小强、小波、旭哥、飞哥、林林、星星、小侯、旭东、妍姐……, 没有你们的帮助,实验就不能顺利完成。
最后向参加论文答辩和评阅的各位专家、老师、同学们致以诚挚的谢意!
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