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多功能智能型凝胶药物递送系统的构建及其抗肿瘤联合治 疗应用

发布时间:2022-11-09 10:59
目录
第1 章 绪论 1
1.1引言 1
1.2肿瘤纳米医学 2
1.2.1纳米医学的发展 2
1.2.2纳米药物肿瘤传递的局限性 3
1.2.3新型纳米药物的设计 5
1.2.3.1活细胞介导的纳米药物传递 5
1.2.3.2细胞膜包覆的纳米颗粒用于药物传递 10
1.2.3.3局部药物递送 13
1.3多功能水凝胶载体材料的设计 13
1.3.1纳米凝胶的合成方法及特点 14
1.3.2响应型纳米凝胶的生物医学应用 14
1.3.2.1单一刺激响应型 NGs 15
1.3.2.2双重/多重刺激响应型 NGs 17
1.3.3可注射水凝胶的特点 18
1.3.4可注射水凝胶的生物医学应用 19
1.4本论文的研究内容及创新点 20
1.4.1研究内容 20
1.4.2创新点 22
参考文献 22
第2 章 巨噬细胞归巢作用介导载药透明质酸纳米凝胶用于肿瘤的光热/化疗联 合治疗 33
2.1引言 33
2.2实验部分 34
2.2.1实验试剂 34
2.2.2材料的合成 35
2.2.2.1HA NGs 的制备 35
2.2.2.2HA@PPy NGs 的制备 35
2.2.2.3HA/DOX@PPy NGs 的制备 36
2.224 MAs-HA/DOX@PPy NGs (MAs-NGs)的制备 36
2.2.3材料表征 36
2.2.3.1水动力学粒径与Zeta电势分析 36
i
2.2.3.2紫外-可见吸收光谱分析 36
2.2.3.3材料形貌表征 36
223.4傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析 37
2.2.3.5体外光热性能测试 37
2.2.4体外药物释放行为研究 37
2.2.5细胞实验 37
2.2.5.1细胞培养和材料的细胞相容性评价 37
2.2.5.2巨噬细胞对载药纳米凝胶的吞噬量研究 38
2.2.5.3体外巨噬细胞迁移实验 39
2.2.5.4巨噬细胞分型评价 39
225.5MAs-NGs的体外热成像性能评价 39
225.6DOX和NG从MAs-NGs的释放以及MAs-NGs的体外抗肿瘤效果
评价 40
2.2.6动物模型 40
2.2.7体内荧光成像 41
2.2.8体内肿瘤热成像 41
2.2.9体内抗肿瘤治疗 41
2.2.10体内生物安全性评价 42
2.2.11统计学分析 42
2.3结果与讨论 42
2.3.1HA/DOX@PPy NGs 的合成与表征 42
2.3.2细胞相容性和细胞吞噬量研究 48
2.3.3Transwell 迁移和巨噬细胞分型评价 50
2.3.4MAs-NGs的体外光热性能分析 51
2.3.5DOX和NGs从MAs-NGs的释放以及MAs-NGs的体外抗肿瘤效果评
52
2.3.6MAs-NGs 向体内肿瘤模型的递送 54
2.3.7体内热成像性能分析 55
2.3.8体内抗肿瘤治疗效果评价 56
2.3.9生物安全性评价 58
2.4本章小结 59
参考文献 59
第3 章 巨噬细胞膜伪装的响应型聚合物纳米凝胶用于磁共振成像引导的原位脑 胶质瘤治疗 65
ii
3.1引言 65
3.2实验部分 67
3.2.1主要实验试剂 67
3.2.2材料的合成 68
3.2.2.1M@P NGs 的合成 68
3.2.2.2PM@P NGs 的合成 68
3.223巨噬细胞膜的提取和MPM@P NGs的制备 69
3.2.3材料的表征 69
3.2.3.1材料表面电势和水动力学直径测试 69
3.2.3.2X射线光电子能谱(XPS)测试 69
3.2.3.3•OH的生成能力评价 69
3.2.3.4抗非特异性蛋白吸附测试 70
3.2.3.5透射电子显微镜(TEM)和元素能谱(Mapping)测试 70
3.2.4顺铂和Mn2+的释放行为研究 70
3.2.5T1弛豫率性能测试 71
3.2.6细胞实验 71
3.2.6.1细胞培养 71
3.2.6.2细胞毒性分析 71
3.2.6.3细胞凋亡检测 72
3.2.6.4细胞吞噬性能分析 72
3.2.6.5细胞内活性氧检测 72
3.2.6.6细胞内谷胱甘肽水平检测 73
3.2.6.7体外BBB模型的构建和BBB穿透实验分析 73
3.2.7动物模型 74
3.2.8体内Ti MR成像性能分析 74
3.2.9体内抗肿瘤效果分析 74
3.2.10体内药代动力学和生物分布评价 75
3.2.11体内生物安全性分析 75
3.2.12统计学分析 76
3.3结果与讨论 76
3.3.1MPM@P NGs的合成与表征 76
3.3.2Cisplatin 和 Mn2+的释放行为 81
3.3.3Ti弛豫性能分析 82
3.3.4细胞毒性与细胞凋亡性能分析 82
iii
3.3.5细胞吞噬性能分析 85
3.3.6细胞内活性氧检测及GSH含量测试 86
3.3.7体外BBB穿透能力分析 87
3.3.8体内原位脑胶质瘤的Ti MR成像性能分析 89
3.3.9体内原位脑胶质瘤的联合治疗分析 89
3.3.10药代动力学和组织分布研究 92
3.3.11体内生物相容性评价 93
3.4本章小结 95
参考文献 96
第4 章 可注射多功能水凝胶在抗肿瘤联合治疗中的应用 101
4.1引言 101
4.2实验部分 103
4.2.1实验试剂 103
4.2.2材料的合成 104
4.2.2.1GPI NPs 的合成 104
4.2.2.2可注射水凝胶的合成 104
4.2.3材料的表征 105
4.2.2.1水动力学直径和表面电势测试 105
4.2.3.2透射电子显微镜(TEM )测试 105
4.2.3.3扫描电子显微镜(SEM)测试 105
4.2.3.4傅里叶变换红外光谱(FTIR)测试 105
4.2.3.5流变性能测试 105
4.2.4GOx酶活性评价 106
4.2.4体外-OH 的产生 106
4.2.5细胞毒性与细胞吞噬性能检测 106
4.2.6细胞内OH的检测 107
4.2.7体外TAMs复极化性能评价 107
4.2.8动物模型 107
4.2.9体内治疗 108
4.2.10统计学分析 108
4.3结果与讨论 108
4.3.1GPI NPs的合成与表征 108
4.3.2GPI@ALG水凝胶的合成与表征 110
4.3.3水凝胶的体内成胶性能分析 110
iv
4.3.4催化活性评价 112
4.3.5细胞毒性和细胞吞噬性能分析 113
4.3.6肿瘤相关巨噬细胞的体外复极化性能分析 114
4.3.7体内抗肿瘤治疗 116
4.3.8体内生物相容性评价 118
4.4本章小结 119
参考文献 120
第5 章 结论与展望 125
5.1本论文主要结论 125
5.2展望 127
仪器和设备信息表 129
攻读学位期间的研究成果 131
致谢 133
第1 章 绪论
1.1引言
尽管在医学护理和疾病治疗方面已经取得了重大的进展,但在过去几十年中 全球癌症患病率持续上升,癌症仍然是仅次于心血管疾病的第二大死亡原因,也 是提高各国人口预期寿命的重要障碍。随着人口老龄化的不断加剧和人口数量的 增长,全球癌症的发病率和死亡率正在迅速增加,给社会经济发展带来了沉重的 负担,也给人类生命健康造成了巨大威胁。根据世卫组织国际癌症研究机构
(IARC)公布的2020年全球癌症统计数据显示[], 2020年全球新增癌症病例达 到1930万,癌症死亡病例996万,其中仅中国新发癌症患者就有457万人,占 全球新增癌症病例总数的23.7%;中国癌症死亡人数高达300万,占全球癌症死 亡病例数的近1/3,中国的总体癌症死亡率(65.6%)是美国总体癌症死亡率(26.7%) 的 2 倍多,我国癌症治疗技术与发达国家之间整体存在较大差距[2]。报告还指出, 预计2040年全球癌症病例将达到2840万,比2020年增加47%,癌症负担正在 持续加剧。因此,发展新的抗癌技术推进癌症的预防和早诊早治,是控制全球癌 症、提高癌症患者生存率和治愈率的有效措施。
随着癌症研究的不断深入和医疗技术的发展,目前各种新的治疗方式,如免 疫治疗、光热/光动力治疗、基因治疗和激素治疗等正在出现,然而外科手术、放 疗、尤其是化疗依然是大多数癌症患者的一线治疗选择[3]。但是,常规化疗具有 高度非特异性,在将药物运输至癌细胞的过程中也会杀死正常细胞,给患者带来 严重的全身毒性[4]。而且,化疗药物还具有水溶性差、病变部位药物浓度不足、 非特异性组织分布、较大的细胞毒性和多药耐药性等缺点,严重限制了其抗肿瘤 治疗效果,并会导致脱发、肾毒性、黏膜炎等严重副作用的产生[5]。因此,亟需 开发新型的药物递送系统(Drug delivery systems, DDS )以提高化疗药物的递送 效率和治疗效果。
纳米医学(Nanomedicine)的兴起和发展有望改变上述传统药物递送系统中 的缺陷[6-8]。纳米医学是一个多学科交叉研究领域,它将纳米科学和纳米技术,以 及化学、生物、材料科学和医学等学科融入到生物医学应用中[9]。纳米载体具有 纳米尺寸、较高的比表面积、以及良好的物理化学特性等独特的性质[10]。它们可 以通过调节药物的药代动力学和药效学特征,从而提高其治疗效果。将药物负载 到纳米载体内可以增加其体内稳定性,延长载药纳米复合物的血液循环时间,并 有调节药物可控释放的潜力。近几十年来,纳米医学利用纳米材料独特的物理化 学性质为克服传统治疗的局限性,提高肿瘤诊疗效果做出了突出的贡献(图1-1)
 
 
1.2肿瘤纳米医学
1.2.1 纳米医学的发展
得益于纳米医学技术的迅猛发展,各种不同类型的纳米载体药物得到了越来 越多的开发和应用。最早的纳米药物(Nanomedicines)主要为负载了化疗试剂的 纳米颗粒或脂质体,由于实体瘤组织中血管壁间隙较宽,血管结构完整性差且淋 巴回流受阻,使得纳米颗粒或大分子脂质体可以穿过血管壁渗透到肿瘤组织中并 在肿瘤部位富集,这就是增强渗透与滞留效应(Enhanced permeability and retention effect, EPR)。大多数的纳米颗粒可以通过EPR效应被动靶向递送到肿瘤区域[12- 14]。目前,已经有多个纳米药物产品获得了临床审批(图1-2),例如1995 年美 国食品与药品监督管理局(FDA)准批的阿霉素脂质体纳米颗粒(Doxil),主要 用于治疗难治性卵巢癌、多发性骨髓癌以及与艾滋病有关的卡波西肉瘤,阿霉素 脂质体能够在很大程度上降低心脏毒性,提高癌症患者的生存质量;2005 年经 FDA批准在美国上市的白蛋白结合型紫杉醇(Abraxane)纳米颗粒,主要用于转 移性乳腺癌和难愈性非小细胞肺癌患者,还可以联合吉西他滨用于转移性胰腺癌 的一线治疗;2013年FDA又批准了伊立替康脂质体注射液(Onivyde),它与氟 尿嘧啶和亚叶酸联用,可以用于治疗对吉西他滨化疗效果不佳的晚期胰腺癌患者 [15,16].
 
 
图 1-2. 癌症纳米医学领域纳米药物主要发展的历史时间表 [17]
1.2.2纳米药物肿瘤传递的局限性
基于 EPR 效应的被动靶向策略具有自身的局限性,首先,纳米药物在血液 循环过程中容易被网状内皮系统(Reticuloendothelial system,RES)拦截而排出 体外,致使大量的纳米药物无法到达肿瘤周围[18];另外,肿瘤组织中较高的间质 液压和基质密度阻碍了纳米颗粒的穿透和均匀分布,而且细胞外基质中较高的胶 原蛋白含量、交联或取向的纤维排列等也会限制纳米颗粒的扩散[14];同时,纳米 颗粒的理化性质,包括尺寸和形状产生的空间效应、表面电荷等也会影响纳米药 物的渗透和扩散,例如纳米棒比球形纳米颗粒更易于粘附在血管壁的内皮细胞上 [19]。于是,利用靶向配体与同源受体之间的高亲和力作用介导的主动靶向药物递 送策略引起了研究人员极大的兴趣。用特定的靶向配体修饰纳米颗粒,利用其与 癌细胞表面对应受体的识别作用可以提高肿瘤细胞对纳米颗粒的吞噬量,实现特 异性靶向治疗。目前常用的肿瘤细胞靶向配体主要包括叶酸(FA)、透明质酸(HA) 等小分子,大分子多肽(Peptide)和适配体(Aptamer)等[20-22]。另外还有一些 细胞器靶向配体也可以用来修饰纳米材料,以将其靶向运输至亚细胞区域发挥抗 肿瘤治疗效果。
但是不管是基于EPR效应的被动靶向策略还是基于受体-配体相互作用介导 的主动靶向策略,纳米颗粒在进入到体内生理环境以后,均容易与血液或细胞外 基质中的生物大分子(主要是蛋白质)相结合,从而影响纳米药物的循环半衰期, 进而影响药代动力学和组织分布等[23]。纳米颗粒这种与血清蛋白的非特异性结 合是影响其血液循环时间的重要因素,并会干扰细胞摄取和胞内转运行为。表面 修饰了靶向配体的纳米药物在体循环过程中,可能会由于吸附了血清蛋白而使靶 向配体被掩盖在蛋白质下面,表面电荷随之发生改变,流体力学尺寸大幅增加, 从而使靶向配体失效或触发不同的吞噬机制[24]。据报道,延长血液循环时间和降
3
 
低 RES 非特异性清除作用将有利于纳米药物在肿瘤部位的渗透和富集,虽然通 过纳米药物的表面化学改性可以减少血清蛋白的表面吸附,延长血液循环时间, 但在一定程度上也阻碍了肿瘤细胞对纳米药物的摄取。此外,纳米药物一旦进入 到细胞质中,会被包括溶酶体在内的细胞内囊泡包裹隔离,在没有有效的逃逸机 制的情况下可能会被水解酶降解,从而降低了纳米药物的治疗效果。因此,纳米 药物在静脉注射后均需要克服多重生理屏障(如图 1-3),首先经血液循环到达靶 部位,然后在肿瘤部位从血管中渗出,逐步扩散渗透到肿瘤组织内,并被肿瘤细
胞摄取才有可能发挥治疗效果。
 
图1-3.全身给药的纳米药物到达肿瘤细胞内经历的各种生理屏障。(a)在体循环中,纳米
药物面临着与血细胞或蛋白的相互作用;(b)单核吞噬系统(MPS)及(c)肿瘤血管屏
障;(d)肿瘤基质和细胞外基质;(e)癌细胞膜和内部细胞器的相互作用,这些因素均会
降低达到靶部位的注射剂量比例[25]。
由此可见,高效递送纳米药物到肿瘤部位及肿瘤细胞内是抗肿瘤纳米药物获 得高疗效的关键。对于全身给药方式(Systemic drug delivery),其治疗效果均依 赖于免疫系统逃逸、跨越生理屏障以及靶向肿瘤组织的能力。浙江大学申有青教 授团队即将经静脉注射的全身给药方式归纳为以下五步级联的输送过程(CAPIR Cascade):分别经由血液循环(Circulation, C)、肿瘤蓄积(Accumulation, A)、瘤 内渗透(Penetration, P)、肿瘤细胞吞噬(Internalization, I)以及胞内药物释放(Drug release, R)五个过程[26]。为了克服CAPIR级联输送过程中各个复杂的生理屏障, 亟需开发设计不同类型的纳米药物输送平台,促进药物向肿瘤位置的高效递送。
1.2.3 新型纳米药物的设计
为了提高抗肿瘤药物的传递效率,近年来,利用内源性蛋白[27]、内源性活细 胞[28,29]或者细胞膜伪装技术[30]设计的新型药物递送平台作为一种有前景的仿生 药物递送策略,在全身给药方式方面得到了越来越多的研究和关注。这种内源性 的纳米载体或细胞膜包覆的纳米药物可以增加其被机体识别为内源性物质的能 力,从而使纳米药物“隐身”,一方面可以减少RES单核吞噬系统的捕获和清除, 另一方面在肿瘤相关细胞因子的诱导下,有望跨越体内的生理屏障,实现不同的 生物效应和靶向特异性结合,对肿瘤组织甚至转移的癌细胞进行更加精确的追踪 定位和可控制的药物释放。另外,利用局部药物递送(Local drug delivery)策略 将治疗性试剂局限在肿瘤区域内,从而最大限度的提高药物活性,控制药物在肿 瘤组织的特定释放,这对于未转移的实体瘤或用于术后防止复发和转移,也是一 种不错的选择[31-33]。有望在达到良好的肿瘤治疗效果的同时减少对正常组织器官 的毒副作用。
1.2.3.1活细胞介导的纳米药物传递
人体是由许多种具有不同生理功能的细胞组成的,例如有的可以伴随血液长 时间循环,有的可以向特定部位迁移,有些可以穿越生理屏障等等。保留了细胞 结构和生物功能的某些类型的活细胞可以用来吞噬载药纳米颗粒进行药物的靶 向传递,例如红细胞(Red blood cells, RBCs),干细胞(Stem cells, SCs)和一些 免疫细胞。血红细胞的寿命较长,红细胞膜的半透膜特性允许小分子在细胞内环 境和外循环之间被动扩散[34]。许多类型的干细胞,包括间充质干细胞(MSCs) 和神经干细胞(NSCs)已被证明具有向肿瘤微环境迁移的能力[35,36]。免疫细胞, 包括单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞和淋巴细胞等对伤口、炎症和 肿瘤部位具有趋向特性,倾向于向肿瘤部位迁移聚积。这些特点使细胞与载药纳 米颗粒的结合具有独特的优势,(1)携带载药纳米颗粒的细胞可以将药物靶向运 输到病变部位;(2)延长药物的半衰期;(3)控制药物的释放;(4)减少药物的 免疫原性和细胞毒性[37,38]。
5
 
 
巨噬细胞,NPs和free DOX在荷瘤小鼠体内的瘤内均匀分布和滞留特性[39]。
(1)巨噬细胞介导的药物递送 我们知道,巨噬细胞具有捕获外来物质的特性,载药纳米颗粒能够通过体外 培养的方式被巨噬细胞负载或吞噬,然后回输回体内随巨噬细胞迁移到肿瘤组织 聚积,甚至可以穿过血脑屏障( Blood-Brain Barrier, BBB )进入大脑部位进行神 经系统疾病的治疗[40]。例如,Huang。9】等人用负载DOX的血清白蛋白(SA)均 匀包覆光热试剂金纳米棒(Au NRs ),制备得到了核-壳结构的载药纳米平台 NR@DOX:SAs,然后将NR@DOX:SAs背负在小鼠巨噬细胞表面,进而有效递 送到肿瘤部位进行前列腺癌的治疗(图 1-4)。巨噬细胞的使用可以改善药物在瘤 内的分布情况(如图1-5D),巨噬细胞介导组的荧光区域面积占27.5%,大于单 独的材料14.5%和单独的DOX 18.5%,瘤内滞留时间也显著延长(图1-5A, B)。 白蛋白壳层不仅具有可降解特性和良好的生物相容性,还可以作为药物存储库
(Drug reservoir)延迟内吞药物的释放,在运输途中阻隔负载的化疗药物对载体 细胞的不良影响。而当巨噬细胞将药物运载到肿瘤位置以后,利用 NIR 光照射 肿瘤, Au NRs 产生光热作用破坏宿主细胞从而促进负载药物释放到周围的环境 中。这种光热治疗和化疗的有效结合协同增强了体内/体外的肿瘤治疗效果。
已经有不少研究利用这种“背包”方法成功将治疗试剂装载在干细胞[41,42]、 白细胞[43,44]、红细胞[45]或 T 细胞[46]表面,但是细胞膜对细胞的正常功能和可塑 性至关重要,在细胞表面负载了 NPs可能会对细胞的信号传导、粘附和迁移等产 生不利影响。
6
 
 
图1-5.化疗药物的滞留和生物分布评价。(A)在瘤内注射SA,NR@DOX:SAs和RAW- NR@D0X:SA后第0-7天获得的荷瘤小鼠的体内近红外荧光图像。其中SA均用Cy5.5进 行标记。(B)定量分析选定区域内的总荧光强度值和对应的荧光强度比率(Fx/Fo, Fx是指
测定日期的荧光值,Fo代表注射后立即获得的荧光信号值)(n=3)。(C-D)注射药物后第
11 天,观察到的瘤内药物分布情况, Scale bar = 5 mm[39]。
另一种策略是可以将药物装载到细胞载体内部,但是需要控制药物的负载量, 药物浓度太高会造成细胞载体的死亡,太低则达不到治疗效果。于是Xie等人[47] 选用巨噬细胞负载的硅基载药纳米胶囊(DSN)进行脑胶质瘤皮下瘤的治疗研究。 他们指出经静脉注射的巨噬细胞约需要6-12 h的时间才能迁移到炎症部位[48,49], T2磁共振成像显示,在注射后4 h肿瘤内的信号变化非常小,而在24 h时观察 到了明显的信号降低(图1-6a)。如果载药纳米颗粒在此运输时间段内不发生有 效的药物泄露,那么即使药物的负载含量较高,也可以降低不良影响。于是他们 设计了一种药物-硅基纳米胶囊,胶囊的核心为载药硅纳米颗粒(DSN),通过调 节硅壳层的厚度(12 /22 /52 nm)可以控制药物的释放量,减少对载体细胞的毒 性作用。通过激光共聚焦显微镜观察肿瘤冰冻切片发现(图1-6b),在静脉注射 后24 h的肿瘤组织中同时观察到了 DiD染色的细胞膜和DOX的荧光,证实巨 噬细胞作为载体可以将DOX成功输送至肿瘤部位。
 
 
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1h 8h 23h
图1-6.在皮下接种了 U87MG肿瘤的裸鼠中评估DSN-MF的体内肿瘤靶向性。(a)静脉注
射预载了氧化铁的DSN-MF细胞后0、1、4和24小时获得的T2 MR图像和(b)肿瘤冰冻
切片的共聚焦显微镜图像。红色为用DiD预标记的DSN-MF细胞,绿色为Dox,蓝色为细 胞核。Scale bar = 50 pm。(c)注射后1、8和23小时获得的全身冠状PET图像,DSN-MF 或MF细胞用64Cu PTSM标记,黄色圆圈内为肿瘤区域,蓝色圆圈内为肺部。(d-e)不同 时间点时各组织中MF细胞(d)和DSN-MF细胞(e)的分布。(f) MF和DSN-MF细胞
在不同时间点的肿瘤聚积以及(g) MF和DSN-MF在肿瘤与肝脏的含量比值[47]。
此外,他们还利用正电子发射断层扫描成像(PET )监测细胞的迁移情况, 发现巨噬细胞在肿瘤内的聚积随着监测时间显著增加(图1-6c),表现出良好的 肿瘤趋化特性。并且,利用巨噬细胞介导DSN的递送(DSN-MF),可以使DSN- MF 的肿瘤/肝脏比例从0.18(1 h)显著增加到0.32(8 h)和0.39(23 h)(图1- 6g),与单独的巨噬细胞MF组之间没有显著性差异(p < 0.05)。表明巨噬细胞 在负载DSN前后具有相似的药代动力学行为(图1-6c-g),DSN的负载未对肿瘤 迁移特性产生明显的影响。
(2)中性粒细胞介导的药物递送
中性粒细胞是含量最丰富的白细胞,约占循环白细胞总量的 50-70 %,是在
炎症感染和肿瘤发生过程中募集到肿瘤部位的主要细胞类型之一,这表明中性粒 细胞可能有助于炎症和癌症的纳米治疗。炎症是身体对病原体、伤害和刺激等风 险因素的正常免疫反应。在恶性肿瘤的进展过程中,肿瘤细胞会产生各种各样的 细胞因子和趋化因子,如肿瘤坏死因子a (TNF-a),干扰素y (IFN-y),白细胞 介素6 (IL-6)等[50],这会导致各种炎症细胞,包括中性粒细胞、巨噬细胞、淋 巴细胞、树突细胞和自然杀伤细胞等被募集进入到肿瘤微环境。进入到肿瘤组织 的中性粒细胞也会分化成两种亚型,1型中性粒细胞(N1)具有抗菌和抗肿瘤功 能,2型中性粒细胞(N2)具有促肿瘤功能[51]。
Inflammatory signals amplification
BBB/BBTB靶向脑肿瘤,释放PTX并抑制胶质瘤复发[52]。
Chu等人[53]发现,白蛋白纳米颗粒可以在体内原位搭载中性粒细胞将药物递 送到肿瘤位置。与TA99抗体一起注射到体内的白蛋白纳米颗粒,可以经由中性 粒细胞介导而在肿瘤部位聚积,这一组合显著抑制了黑色素瘤的生长,增加了小 鼠存活率。在炎症和癌症的发展期间,中性粒细胞可以穿过血脑屏障并迁移到炎 症和肿瘤部位。最近的一项研究表明,装载含有紫杉醇脂质体(PTX-CL/NEs) 的中性粒细胞,在术后的脑胶质瘤模型中可以有效的穿越血脑屏障进入大脑,抑 制脑胶质瘤的复发(如图1-7) [52]。在该研究中用阳离子脂质体包覆PTX构建了 PTX-CL,然后被嗜中性粒细胞吞噬产生PTX-CL/NEs, PTX的药物上载率可以 达到18昭/106个细胞。PTX的负载没有改变嗜中性粒细胞的形态或功能。手术 切除肿瘤后使肿瘤部位的炎症信号显著增强,从而改善了嗜中性粒细胞的肿瘤靶
9 向作用,而且术后脑部发炎部位的炎性细胞因子发生上调,会使中性粒细胞过度 激活而破裂,同时释放出脂质体,将PTX输送到残余的肿瘤细胞中发挥作用。 PTX-CL/NEs 对抑制术后小鼠脑胶质瘤的复发具有良好的效果,但在治疗原发性 小鼠脑胶质瘤方面没有明显的效果,这表明术后炎症信号的放大有助于增强中性 粒细胞对脑肿瘤的靶向能力和PTX-CL/NEs的治疗效果。
1.2.3.2细胞膜包覆的纳米颗粒用于药物传递
细胞膜作为一种天然来源的药物载体已经用于各种载药系统中。聚合物/无 机纳米颗粒(NPs)载体能够实现药物的上载,但由于它们的外源属性,总是容 易被单核吞噬系统捕获而从身体快速清除。细胞膜包覆的 NPs 载药体系可以伪 装成自己人避免被捕获,实现良好的药物传递功能。
(1)红细胞膜(RBCm )包覆的纳米颗粒
红细胞膜包覆技术是由Zhang[54]课题组在2011年提出的(如图1-8),随后 陆续被用于多种不同用途的体系中[55,56]。这种红细胞膜包覆的纳米颗粒(RBC- NPs) 一般通过三步法来制备。简单地说,首先通过离心和低渗溶液处理去除血 红蛋白,将其从全血中分离出来。然后通过聚碳酸酯多孔膜(100-400 nm)挤出 可以很容易的制备得到尺寸约100 nm的RBCm囊泡。最后将RBCm囊泡与NPs 共挤出若干次次以将两者融合在一起。TEM可以观测到NPs核心外面的脂质双 分子壳层的厚度约7-8 nm,且其zeta电位值与RBCm囊泡的值非常接近,两种 结果均可以说明RBCm包覆成功。其中有几个因素会影响膜/颗粒的组装过程, 例如:膜/聚合物的比例,纳米颗粒的表面电荷以及颗粒直径[56]。
 
RBC membrane Polymeric NP RBC membrane
derived vesicles cores camouflaged NPs
图1-&红细胞膜包覆的PLGA纳米颗粒(RBC membrane-PLGA NPs)的合成路线示意图 [54]。
 
天然红细胞膜的包覆延长了纳米颗粒的血液循环时间,然而,RBCm上不含
10 任何特异性针对癌细胞的靶向分子,因此不能进行主动肿瘤靶向。
(2)癌细胞膜包覆的纳米颗粒
尽管癌细胞臭名昭著,但也有一些独特的属性,例如它们具有无限复制的潜 力,可以抵抗细胞死亡[57]。尤其是免疫逃逸和同源结合能力,依靠癌细胞的表面 膜蛋白可以很好的克服免疫清除和非特异性结合的困境。Zhao[58]等人即采用不 同来源的癌细胞膜(来自人乳腺癌细胞(MDA-MB-435)、人前列腺癌细胞(DU 145)、人鳞癌细胞(CAL 27)和结直肠癌细胞(HCT 116))包覆上转换纳米颗 粒 CC-UCNPs,得到 MDA-UCNPs、DU-UCNPs、CAL-UCNPs 和 HCT-UCNPs, 以研究同源靶向能力。同时还将叶酸靶向配体修饰的 FA-UCNPs 和红细胞膜包 覆的RBC-UCNPs作为对照。结果发现,修饰了 FA和包覆了细胞膜的纳米颗粒 均表现出了不同程度的免疫逃逸能力,而且同源肿瘤细胞膜对相应的肿瘤模型显 示出最优的靶向能力,而当细胞膜供体细胞与宿主模型之间不匹配时靶向性能会 显著降低(图 1-9)。
 
 
(3)其他细胞膜包覆的纳米颗粒
除了红细胞膜和癌细胞膜以外,到目前为止,还有许多其他类型的内源性细 胞膜如:白细胞膜[59],巨噬细胞膜[60],自然杀伤(NK)细胞膜[61 ]等均可以用来 制备细胞膜包覆的纳米颗粒,他们分别具有各自的优势和特点。Zhang等人[60]利 用巨噬细胞膜上的细菌识别受体与细菌中不同病原体相关分子模式之间的潜在 相互作用,用细菌预处理的巨噬细胞膜涂覆 Au-Ag 纳米立方体,实现了更有效 地细菌靶向效果。巨噬细胞是一种重要的免疫细胞,它们能够检测并响应由损伤 、感染或疾病等产生的内源性刺激。有趣的是,巨噬细胞膜上不仅具有用于病原
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体识别的受体,可以检测到来自病毒、细菌、分枝杆菌、真菌和寄生虫等不同的 病原相关分子模式(PAMPs) [62],还能识别肿瘤区域产生的相关细胞因子,如集 落刺激因子(CSF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子(TNF-a)等, 受各种趋化因子的诱导可以携带药物输送到肿瘤组织[47]。
 
如图1-10所示,Zhao课题组用聚多巴胺纳米颗粒(P/T)负载免疫调节剂
(TMP 195),再用巨噬细胞膜(Macrophage membrane, MM)进行包覆,以将 其特异性运送到肿瘤位置。TMP 195作为一种肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的逆 转试剂,可以将TAMs极化为抗肿瘤的M1型。携带免疫调节剂的该仿生纳米颗 粒(P/T@MM),最终使肿瘤清除率从光热治疗组的10%提高到了 60%[63]。此外, NK细胞作为一种先天免疫细胞,是抵御感染和癌症的第一道防线。NK细胞膜 具有跨越体内生理屏障靶向肿瘤区域并诱导M1型巨噬细胞极化的潜力,同时还 可以通过提供细胞膜免疫诱导物刺激免疫系统进行肿瘤的免疫治疗[64]。
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1.2.3.3局部药物递送
除了全身给药以外,局部给药策略也成为了一种靶向治疗恶性肿瘤的有效措 施。常见的局部给药途径通常有外用型微针贴片、植入式可降解支架或可注射水 凝胶等[65],它们通过将药物局限在病灶范围内,使药物在肿瘤或病灶部位实现持 续、可控的释放,以提高治疗效果并减少全身毒性[66,67]。其中微针贴片作为微创 内皮给药有望用于治疗皮肤癌,植入式支架材料则由于需要进行手术,适合与手 术治疗同时使用, 而可注射水凝胶由于具有高可注射性、无创性、触变性和易于 给药等优点而备受关注[68]。例如在临床上,手术切除是治疗原发性乳腺癌的主要 干预策略。但是,乳腺癌术后局部复发的风险在10%到41%之间,仍然是临床上 非常棘手的问题。Liao等人[69]于是设计了一种温敏性、可注射的混合纳米水凝胶 平台,将PLGA多孔微球与光热试剂IR820负载到低温条件下的甲基纤维素中, 形成了 IR820/Mgel,使IR820在肿瘤位置的滞留时间显著延长,而且在通过光热 治疗预防乳腺癌复发的同时,还可以填充乳房垫,有利于后续的乳房重建。除此 以外,临床上发现免疫治疗存在比较大的个体化差异,只有一小部分患者在免疫 治疗中获得了临床受益,而相当一部分病人对免疫治疗具有较低的应答。Fang及 其合作者[32]利用硫代硫酸软骨素和两亲性甲基丙烯酸聚醚F127形成的胶束之间 的硫醇-烯点击化学反应,制备得到可注射水凝胶,然后将疏水性的免疫检查点 抑制剂(d-1MT)包裹在F127的核心,亲水性的吉西他滨(GEM)分散在水凝 胶网络中,从而控制化疗药物和 d-1MT 在肿瘤组织中的持续释放,通过水凝胶 结合化疗和免疫治疗的局部给药方法促进了细胞毒性 T 淋巴细胞的浸润,诱导 显著的抗肿瘤免疫反应,有效地抑制了肿瘤的转移。
1.3多功能水凝胶载体材料的设计
如今,药物载体的设计在一些急慢性疾病(如肿瘤和神经退行性疾病)的先 进治疗方案的制定中起着主导作用。在原子和分子水平上调整材料组分可以提供 不同类型的药物载体,包括有机(如脂质体、树状大分子、聚合物纳米颗粒和胶 束)、无机(碳纳米管、金属和二氧化硅衍生物纳米结构)和有机/无机杂化体系 [70-72]。这些药物载体在用于传递生物活性物质方面已经进行了很多研究。 “可控 的药物传递(Controlled drug delivery) ”策略的主要目的是在治疗浓度范围内调 节有效载荷的释放,从而将无效治疗或潜在的副作用降至最低[73]。然而,药物载 体的意义并不局限于此,它们还可以用作诊断、监测或治疗平台,以及诊疗和多 功能治疗平台[74,75]。为了获得对靶细胞具有高度选择性、易于被细胞摄取、并且 在细胞质内具有良好稳定性的药物载体,已经有很多研究学者提出了各种不同的 调整药物载体的物理性能、化学和机械特性的方法。其中,水凝胶(Hydrogel)
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和纳米凝胶(Nanogels, NGs)作为一种可以吸水膨胀的三维(3D)网状交联结 构吸引了研究人员极大的兴趣,甚至已经成为一些聚焦于新的制备方法和新的应 用领域的研究主题[76]。
1.3.1纳米凝胶的合成方法及特点
NGs可以定义为亚微米级的水凝胶,其粒径通常在1-1000 nm之间,同时具 备纳米材料和水凝胶的优势。根据交联方式的不同,NGs的合成方法可以分为物 理交联和化学交联两大类:据报道,一些聚合物在温和的反应条件下,利用疏水 作用、静电相互作用或着氢键的形成,在水溶液中自组装即可以形成NGs,这种 方法称为物理交联法[77-79];而小分子单体或大分子聚合物利用光、辐射诱导交联 或者通过化学键交联制备 NGs 的方法称为化学交联法。一般地,可以利用反相 微乳液法(Reverse microemulsion method),由分散在油包水(Water-in-oil, W/O) 非均相体系中的功能单体或聚合物,通过化学交联制备得到NGs[80]。沉淀聚合法 (Precipitation polymerization )则是将单体和交联剂在均相体系中混合均匀,然 后用引发剂引发单体聚合,生成的聚合物链增长到一定程度后发生相分离,并通 过共价键反应进一步形成交联结构的 NGs[81,82]。
水分子能以键合水、束缚水和自由水等形式存在于凝胶网络中,因此NGs在 水溶液中具有良好的溶胀性能,与生物组织十分类似,这使 NGs 拥有良好的生 物相容性。而且, NGs 的软物质特性和流动性也使其更易于被肿瘤细胞吞噬[83,84], NGs 表面通常还具有氨基、羧基、羟基或醛基等丰富的官能基团,易于进行功能 化修饰,内部则可以负载活性药物,这使得 NGs 比脂质体、胶束、聚合物多聚 体等具有更优越的载体特性。尤其值得注意地是,一些NGs会对外部(如光、 温度、磁)或内部环境中的刺激(如pH、GSH、ROS或生物分子识别)产生响 应而发生一些物理化学性质的变化[85,86]。
 
图1-11.刺激响应型纳米凝胶(NGs)及其生物医学应用示意图[87]。
 
1.3.2响应型纳米凝胶的生物医学应用
利用响应型 NGs 对不同刺激的响应特性,有望控制其内部负载的活性试剂
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在目标位置进行特异性释放。这种智能型 NGs 的多重优势使其在生物医学领域 引起了极大的关注。刺激响应型 NGs 的制备及其在生物活性分子传递方面的应 用,包括药物、DNA或siRNA、蛋白质、胰岛素传递、光动力治疗试剂、生物 传感和成像剂等,均取得了显著的研究进展(图1-11)[88,89]。
1.3.2.1单一刺激响应型 NGs (1)内源刺激响应型 NGs
肿瘤的异常代谢和增值使肿瘤微环境呈现弱酸性,考虑到正常组织(pH 7.4)、 肿瘤微环境(pH 6.5-6.9)和胞内细胞器(如溶酶体pH 4.5-5.5,核内体pH 5.5- 6.0)之间存在的pH梯度差异,利用pH响应型的NGs运输药物并使其在肿瘤部 位按需释放已经成为一种常用的策略之一。一般来说, pH 响应性聚合物体系可 以分为两类,即具有可电离弱酸或弱碱功能的聚合物体系和具有酸裂解键的聚合 物体系。Shen等人[90]利用壳聚糖(CS)上的氨基和乙二胺四乙酸二酐HEDTAA) 的酸酐基团之间发生反应形成酰胺键,制备得到了 pH响应型CS-EDTA NGs。该 NGs在不同的pH条件下显示出表面成分和电荷的可逆转换。利用这一特性,他 们还将化疗药物喜树碱(CPT)在碱性条件下与NGs混合,然后通过酸化将CPT 转化为CPT内酯,以提高其在NGs内的包封效率。结果表明,CPT在CS-EDTA NGs内的上载量为12%,远高于聚合物胶束的药物上载量。
还原型谷胱甘肽(GSH)是一种重要的抗氧化剂,癌细胞内通常具有较高浓 度的GSH (1-10 mM)以保护自身免受外部氧化应激的损害[91]。因此,对GSH 具有响应性的 NGs 正在吸引广泛的研究兴趣[92-94]。已经有很多报道利用二硫键 (S-S) [95,96]、双硒键(Se-Se)卩7】等对还原敏感的化合物作为交联剂,成功制备 了生物还原响应的NGs。癌细胞内高水平的GSH可以作为电子供体还原S-S或 Se-Se键等可还原的化学位点,从而使NGs的交联剂断裂并发生解体,持续释放 出治疗药物。据报道,顺铂会与细胞内含有巯基的物质(包括GSH)发生结合而 使其失活,这与顺铂的耐药性有一定关系[98,99]。鉴于此,Zhang等人[100]利用透明 质酸(HA)作为基体材料,化疗药物顺铂(CP)作为交联剂,制备得到了负载 阿霉素(DOX)的还原响应型纳米凝胶HA/CP/DOX NGs。癌细胞内高水平的GSH 会使CP交联剂断裂,引发DOX的释放。通过卵巢癌细胞(A2780)及其耐药细 胞株检测GSH响应对细胞毒性的影响,结果发现,HA/CP/DOX + GSH组对A2780 耐药细胞株具有较强的杀伤效果,而其他各治疗组均对该细胞系显示出明显的耐 药性。这说明HA/CP/DOX NGs有望利用GSH与顺铂的结合作用促进DOX的 响应性释放,以克服顺铂的耐药性问题。最近,Ma[101]课题组则利用含二硫键的 交联剂将光敏剂羟基茜草素18 (P18)和化疗药物羟基喜树碱(HCPT)进行交 联,得到一种还原响应的前药纳米凝胶(DPH NGs),用于磁共振成像(MR imaging). 近红外荧光成像(NIRF)和光动力/化疗的联合治疗。如图1-12所示,
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DPH NGs的S-S键可以与肿瘤微环境中的GSH反应而发生断裂,从而使NGs解 体并释放出P18和HCPT,同时使肿瘤区域的GSH水平显著降低,避免了高浓 度GSH对660 nm激光照射下产生的活性氧簇(ROS species)的消耗,有效增强 光动力治疗和化疗的联合治疗效果。
 
图1-12.还原响应的纳米凝胶DPH NGs前药在光动力/化疗联合治疗中的作用原理示意图
[101]
 
对H2O2敏感的各种化学键,如硫醚、硒或硼酸酯键等可以用来制备H2O2响 应的纳米凝胶,以控制药物在肿瘤区域或其他病灶部位的释放。例如,Wang课 题组[102]将负载了凝血酶抑制剂(rivaroxaban, RIVA)的纳米凝胶和葡萄糖氧化 酶(GOx)共同涂覆在人工生物瓣膜上,GOx可以催化体内的葡萄糖氧化,生成 葡萄糖酸和大量的H2O2,这种自供应产生的H2O2可以使双硒键交联的纳米凝胶 发生断裂,从而控制RIVA的释放,持续抑制血栓的形成。另外,由于超氧化物 歧化酶在癌细胞线粒体中的歧化反应增强,使肿瘤细胞内H2O2的浓度(100 yM- 1 mM)通常明显高于正常细胞[103,104],因此对H2O2敏感的纳米载体也可以介导不 同的治疗试剂用于抗肿瘤治疗。
另外,对体内的生物分子,例如葡萄糖、酶、核酸和蛋白等具有响应性的一 些NGs也吸引了大量的关注。比如,葡萄糖响应型的NGs可以根据周围环境中 葡萄糖浓度的改变而发生结构变化,有望用作糖尿病治疗的纳米载体[105]。基质 金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases, MMPs)是一类在肿瘤微环境中高表达的 蛋白水解酶,它可以降解细胞外基质中的各种蛋白成分,破坏组织屏障帮助肿瘤 细胞侵袭和转移[106]。因此对MMPs具有响应性的基质材料可以用来制备酶响应 的药物递送载体,Haijie等人[107]即报道了一种MMP-9和组织蛋白酶B(cathepsin B)双响应的纳米载体可以用于进行吉西他滨的传递。
(2)外源刺激响应型 NGs
外源刺激主要包括温度、光、磁场、电场或超声等,利用外源刺激进行药物
16 递送的优点包括:(1)能精确控制外源刺激的位置和强度(例如磁场和光照);
(2)可以根据治疗需求添加或去除外源刺激;(3)可以叠加使用多重刺激,或 提供多次/连续的刺激用于药物递送等。但是外源刺激介导的药物递送也存在无 法确定和治疗转移性病灶的局限性。
1.3.2.2双重/多重刺激响应型 NGs
显然,具有单一响应的纳米给药体系可以利用外源或内源性刺激触发自身结 构解体,并引起后续的物理性质变化,已被证实可以用于各种不同的生物医学应 用。此外,在单个体系中结合双重或多重刺激响应能力的纳米载体,因具有潜在 增强的响应特性也逐渐吸引了越来越多研究学者的关注。Yang[108]及其合作者以 N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)和丙烯酸(AA)为单体,以含二硫键的N, N'-双 (丙烯酰)胱胺(BAC)为交联剂,利用沉淀聚合法合成了 pH/还原双响应的NGs (P (NIPAM-ss-AA) NGs),并用该NGs作为载体负载化疗药物DOX。该载药 NGs在溶酶体pH条件下发生收缩释放出部分DOX,进入到细胞质中的载药NGs 则可以被细胞内高水平的GSH分解,从而彻底释放DOX。释放出的DOX进而 转移到细胞核内,发挥杀伤肿瘤细胞的功能。N-异丙基丙烯酰胺NIPAM还是一 种典型的温敏单体,当温度高于32 oC时,NIPAM单元会从亲水状态转变为疏水 状态而聚集在一起,因此NIPAM常被用在磁加热[109]或近红外加热[110]体系中作 为温控开关来控制药物的释放。 Peng 课题组[111]即通过引入热响应单元 NIPAM 制备了一种pH/温度双响应的NGs,用于进行化疗药物顺铂的递送。顺铂通过与 羧基的共轭作用负载到NGs中,这种结合作用非常容易被血液循环中的H+和Cl- 破坏,造成药物在循环过程中的提前释放。而引入NIPAM单元以后会使NGs在 37 oC的生理温度下发生收缩,从而减少形成的-COOH与Pt之间的共轭键在血 液循环中的暴露,避免被血液循环中的C1-破坏。而当载药NGs进入到微酸性的 肿瘤部位或肿瘤细胞内以后,高浓度的H+则会破坏-COOH与Pt之间的相互作 用,加速顺铂在肿瘤区域的释放。
Li等人[112]则利用一步合成法制备了对温度/pH/GSH多重响应的阳离子 PVCL-NH2 NGs (图1-13)。该PVCL-NH2 NGs具有均匀的尺寸分布,其体积相 转变温度(VPTT)在32.4 oC,当温度T > 32.4 oC时,NGs的体积会发生收缩。 此外,NGs表面丰富的-NH2基团使其在肿瘤微环境中会吸附H+引发电荷的变化, 这种pH响应性有利于提高其与细胞膜的亲和性,从而更容易被细胞吞噬。而且, 在模拟肿瘤微环境条件下(10 mM GSH, 37 oC) PVCL-NH2 NGs可以逐步发生降 解。他们以该NGs作为纳米平台,修饰或负载各种功能试剂,包括荧光染料FITC、 靶向分子LA、金属Cu离子、光热试剂CuS和化疗药物阿霉素等,形成的 CuS@NGs-LA表现出了对内源刺激pH/GSH和外源刺激NIR的多重响应性释放, 可以有效抑制肝癌的生长和复发。
17
 
 
1.3.3 可注射水凝胶的特点
水凝胶是一种亲水性良好的三维网状聚合物,柔软、有弹性,能够与外部环 境进行物质交换,在水中具有很强的溶胀能力和适当的力学与生物学性能,这使 其有类似于生物活性物质的特性,在伤口修复[113,114]、药物和细胞输送[115,116]、 组 织工程再生[117]、癌症治疗[118]和增强抗炎作用[119]等生物医学领域具有广阔的应 用前景。水凝胶根据合成材料的来源通常可以划分为天然水凝胶、合成水凝胶和 复合水凝胶。其中一些水凝胶在刺激下表现出相变和结构改变,它们在成胶前保 持液态特征,具有可注射性,而在注射到病灶部位以后可以通过在一定的温度下 发生溶胶-凝胶相变、离子交联或点击化学作用聚合、物理自组装或光聚合等方 法原位成胶。这种可注射水凝胶具有独特的优势:(1)可以通过注射器输送至病 灶部位,创伤较小,避免不必要的组织损伤和并发症的发生; (2)注射到肿瘤部 位以后,具有粘弹性的可注射材料在成胶前可以移动和流动,从而可以适应不同 的病灶空间。因此可注射水凝胶作为微创局部给药的一种理想载体,在生物医学 应用领域受到了许多科研人员的关注[120]。
此外,水凝胶最初因为其安全性、无免疫原性和可代谢清除等优点而受到关 注,但是单纯的水凝胶功能比较单一,难以保证各种治疗需求。最近,许多研究 发现,水凝胶的三维网状结构为复合功能纳米材料提供了可能性。通过将纳米颗 粒分散在水凝胶中形成纳米复合水凝胶,不仅可以结合纳米材料的刚性、尺寸稳 定性、热稳定性与水凝胶的软物质特性、亲水性等性能, 还可以赋予水凝胶许多 不同的功能。
18
 
 
1.3.4可注射水凝胶的生物医学应用
如图 1-14 所示,鉴于生物活性聚合物良好的生物相容性和亲水特性,所制 备的可注射水凝胶首先可以作为载体用来负载药物。通过改变水凝胶原材料的浓 度、氧化程度等因素调节水凝胶的流变性能,最终得到具有较强适应能力的自愈 合水凝胶载体,可以有效控制小分子药物的持续释放,从而使其作为药物载体在 癌症的治疗和防止复发、脊髓损伤治疗、帕金森病治疗、骨关节炎治疗、眼部或 脑部疾病的治疗等方面具有广泛的应用。例如,Yang等人[122]以锌离子为金属节 点,利用相转移策略制备了一种金属有机水凝胶(MOGs), MOGs表现出剪切变 稀、可注射和自愈合特性,而且具有pH响应的药物释放能力。负载了 DOX和 葡萄糖氧化酶的 MOGs 可以通过阻塞肿瘤血管、切断营养供应的饥饿治疗和联 合化疗等协同抑制肿瘤生长。
皮肤作为人体最大的器官,可以保护身体免受外界病菌或刺激的伤害。皮肤 一旦出现严重缺损,会影响人们的生命和健康,因此,需要具有良好抗菌性能的 敷料来避免伤口感染。生物相容性良好,具有抗氧化、抗菌和抗感染等多种功能 的可注射水凝胶非常适合用于促进伤口愈合。 Shah 等人[123]即利用硫酸软骨素 (CS)和海藻酸钠(SA)制备了一种可注射水凝胶,该水凝胶具有良好的抗菌、 抗炎和止血作用,可以增强创面微环境的再上皮化,增加血管生成和胶原沉积, 从而达到有效促进糖尿病创面的愈合的效果。
另外,水凝胶可以模拟细胞外基质的物理结构促进细胞增殖和组织再生,例 如用于软骨[124]、肌腱[125]或骨缺损[126]的修复等,还可以作为植入式生物传感器 的理想基质材料[127],水凝胶作为 3D 打印类组织结构的生物墨水也逐渐受到了 广泛关注[128]。
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1.4本论文的研究内容及创新点
1.4.1 研究内容
纳米载体在肿瘤诊断治疗中面临的主要问题包括:(1)如何使纳米药物跨越 体内的生理屏障,高效递送到肿瘤部位;(2)如何实现纳米药物的智能可控释放, 减少对正常组织的副作用;(3)如何结合不同的治疗模式,实现优势互补,实现 肿瘤的精准治疗。本论文基于纳米凝胶或可注射水凝胶设计并构建了细胞载体治 疗、细胞膜伪装技术、和局部给药策略等多功能智能型药物递送平台。利用巨噬 细胞或细胞膜的肿瘤趋向(Tumor-tropic)特性,减少纳米药物被网状内皮系统的 拦截,促使其跨越体内生理屏障有效的主动靶向到肿瘤组织。而局部给药方式则 通过将更多药物局限在肿瘤部位,从空间和时间上控制药物的可持续性释放,以 避免全身给药带来的系统性毒性。论文的主要研究内容如下:
(1)巨噬细胞归巢作用介导载药透明质酸纳米凝胶用于肿瘤的光热/化疗联合治 疗
为了构建新型靶向纳米药物递送体系,在论文的第二章,我们以巨噬细胞 (MAs)作为载体,利用其肿瘤归巢特性介导负载了光热试剂和化疗药物的透明 质酸纳米凝胶(H A/DOX@PPy NGs)特异性靶向至肿瘤部位,并通过光热试剂 产生的光热升温作用调控化疗药物在肿瘤部位的特异性释放,实现巨噬细胞靶向 的光热/化疗联合治疗。首先,通过动态光散射(DLS)、透射电子显微镜(TEM)、 傅里叶变换红外光谱(FTIR)及热重分析(TGA)等技术对合成的纳米凝胶进行 基础表征。利用 CCK-8 细胞毒性实验评价载药纳米凝胶对巨噬细胞载体的毒性 影响,研究细胞载体最佳的吞噬时间和吞噬浓度,以制备负载了载药纳米凝胶的 MAs-NGs。然后通过transwell实验和流式细胞分型实验考察药物的负载是否会 影响细胞载体的肿瘤归巢特性及分型情况,并考察了 MAs-NGs在体外和体内的 光热升温效果。随后,研究了化疗药物在存在/不存在近红外激光(NIR)时,从 MAs-NGs 中的药物释放曲线,并进一步探究其在不同条件下对体外癌细胞的杀 伤效果。之后,建立皮下乳腺癌(4T1 )肿瘤模型,通过小动物荧光成像研究其 体内的肿瘤归巢作用,并进一步评价各治疗组对小鼠皮下瘤模型的抗肿瘤治疗效 果(对应论文第二章)。
(2)巨噬细胞膜伪装的响应型聚合物纳米凝胶用于磁共振成像引导的原位脑胶 质瘤治疗
通过第二章的研究可以看到,细胞载体表现出了优异的肿瘤靶向效果,但是 为了不影响载体的生物功能,其载药效率仍然相对较低,而且活细胞容易被细胞 因子激活,具有引起局部炎症的风险。与活细胞相比,细胞膜可以保留细胞上的
20 特异性靶向蛋白,而且由于缺乏细胞活性,降低了炎症风险。于是在第三章,我 们尝试利用细胞膜伪装技术协助纳米药物制剂跨越血脑屏障(BBB)进行原位脑 胶质瘤的治疗。在此,设计了巨噬细胞膜包覆的负载二氧化锰(MnO2)和顺铂 的多功能响应型纳米凝胶,用于磁共振成像(MR)引导的原位脑胶质瘤的化疗 /化学动力学治疗。首先,利用不同手段系统表征制备的纳米凝胶,包括水动力学 粒径、表面电势变化、MnO2的价态和晶体结构、包膜前后NGs的形貌变化和抗 非特异性蛋白吸附情况、巨噬细胞及细胞膜上a4、卩1整合素受体的表达等。并利 用亚甲基蓝作为指示剂,研究体外羟基自由基(•OH)的生成情况。CCK-8细胞 毒性实验用来考察经不同处理后癌细胞(C6)和正常细胞(bEnd.3)的细胞存活 率及对应的IC50值,并通过流式细胞术进一步验证癌细胞的凋亡情况。随后用活 性氧检测试剂盒(DCFH-DA)作为荧光探针,通过激光共聚焦显微镜和流式细 胞术分析肿瘤细胞内活性氧的产生。在transwell体系中构建体外BBB模型,并 通过测试穿透百分比及对下室肿瘤细胞的杀伤效果评估各组NGs穿越BBB的效 率,蛋白印记实验则用来表征引起肿瘤细胞凋亡的潜在机制。最后,通过原位脑 胶质瘤模型验证其在体内穿越BBB靶向脑胶质瘤的效果,并用MR成像监测原 位瘤的体积变化,评价体内抗肿瘤联合治疗效果(对应论文第三章)。
(3)可注射多功能水凝胶在抗肿瘤联合治疗中的应用
除了上述全身给药途径,利用可注射水凝胶局部递送抗肿瘤药物由于可以从 空间和时间上控制药物的释放,降低全身给药带来的相关副作用,也是一种很有 前景的给药策略。在第四章中,我们利用海藻酸盐(ALG)溶液与生理环境中的 Ca2+之间的离子交联作用形成水凝胶,同时可以将治疗试剂局限在水凝胶网络内, 从而构建得到一种可注射的多功能水凝胶(GPI/R848@ALG)。对制备的水凝胶 进行表征,以考察其形貌特征、组成成分和力学特性。通过小动物荧光成像和荧 光显微镜观察荧光标记的海藻酸溶液注射到小鼠体内以后的成胶情况,确定最佳 的ALG溶液浓度,以用于后续的体外、体内实验。通过检测pH值的变化和H2O2 的生成评估葡萄糖氧化酶(GOx)的活性,用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作 为指示剂考察体外OH的产生。然后评价体外细胞毒性和细胞吞噬行为,并通过 流式细胞术验证不同组分的多功能水凝胶在体外对肿瘤相关巨噬细胞(TAMs) 的复极化情况。最后进一步构建皮下肿瘤模型,瘤内注射多功能纳米凝胶溶液, 通过记录肿瘤体积和小鼠体重变化、小鼠存活率情况评价其体内治疗效果,并将 治疗结束后的肿瘤组织切片进行苏木精-伊红( Hematoxylin-eosin staining, H&E) 和 TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色,确认肿瘤坏死和凋亡 情况。本研究利用可注射水凝胶将不同的治疗试剂局限在肿瘤部位,并控制药物 在肿瘤部位的持续释放,减少对正常组织的毒副作用,为纳米药物的靶向递送提
21
供了一种有潜力的多功能纳米平台(对应论文第四章)。
1.4.2 创新点
为了提高纳米载体的肿瘤特异性,改善癌症治疗效果并减少对正常组织的毒 副作用,本论文利用纳米凝胶或水凝胶载体材料设计了不同的多功能智能型纳米 平台,将其与细胞治疗、细胞膜伪装技术、和局部给药等新型药物递送策略相结 合,其创新点在于:
(1)利用巨噬细胞的肿瘤归巢作用将载药纳米凝胶靶向递送到肿瘤位置, 并通过近红外激光调控药物在肿瘤部位特异性释放,实现小鼠乳腺癌的光热治疗 /化疗联合治疗。
(2)提出了负载 MnO2 和顺铂的还原响应型多功能纳米凝胶并包覆巨噬细 胞膜,利用巨噬细胞膜上的整合素受体a4、卩1与肿瘤区域高表达的血管细胞粘附 分子(VCAM-1)之间的相互作用,协助纳米药物跨越BBB并靶向到原位脑胶 质瘤,实现原位脑胶质瘤的T1 MR成像和化学动力学/化疗联合治疗。
(3)利用ALG与内源性Ca2+的可注射原位凝胶化策略实现纳米药物的局 部递送,巧妙地将饥饿治疗(GOx)、增强化学动力学治疗(Fe3O4)和肿瘤微环 境调节结合,用于肿瘤的联合治疗。
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第2 章 巨噬细胞归巢作用介导载药透明质酸纳米凝胶用于
肿瘤的光热/化疗联合治疗
2.1引言
癌症是威胁全球人类生命健康的重要疾病之一,早诊断、早发现、早治疗, 可以大大增加癌症治愈的机会。目前治疗癌症的常规方法包括手术、化疗、放疗、 免疫治疗等,化疗作为手术前/后辅助治疗癌症的主要手段,仍然具有缺乏特异 性、水溶性差、细胞渗透率低、对正常组织细胞具有较强的副作用等缺点。得益 于纳米医学技术的迅猛发展,为了克服癌症常规治疗手段存在的局限性,各种不 同类型的纳米载体(Nanocarriers)和靶向试剂(Targeting ligands)得到了越来越 多的开发和应用[1,2]。
一方面,利用纳米颗粒(NPs)在肿瘤组织的增强渗透和滞留效应(EPR) 可以增加负载的抗癌药物在肿瘤位置的被动靶向聚积[3]。常用的纳米载体主要包 括:(1)聚合物类纳米载体(Polymeric nanocarriers)[4,5],例如:聚合物胶束 (Polymeric micelles)、树状大分子(Dendrimers)、纳米凝胶(Nanogels)、和纳 米微球(Nanospheres)等;(2)脂质纳米载体(Lipid nanocarriers) [6],如:脂质 体(Liposomes)、磷脂胶束(Phospholipid micelles); (3)金属/无机纳米载体(Metal and inorganic nanocarriers)[7-9],女如金纳米颗粒(Au NPs)、磁性纳米颗粒(Magnetic NPs)、介孔硅(Mesoporous silica)>量子点(Quantum dots)等。其中天然高分 子成分的纳米凝胶由于其优异的生物相容性、水溶性、可降解性和较高的载药效 率等优点而在药物传递中具有很大的潜力[10]。另一方面,为了进一步提高药物的 递送效率,还可以通过修饰叶酸(FA)、透明质酸(HA)、抗体(Antibody)、多 肽(Peptide)、适配体(Aptamer)等与癌细胞表面特定受体具有高度亲和力的靶 向配体,使纳米载体主动靶向到肿瘤位置[11-14],进一步提高纳米载体在肿瘤位置 的特异性聚积,增加在癌症治疗过程中的安全性和有效性。
然而,这些人工合成的有机或无机纳米载体均具有一定的“非我(Non-self)” 特性,仍然存在许多障碍限制了其进一步应用,例如机体自身的生理屏障,肿瘤 的异质性,氧含量低、间质液压升高等异常的肿瘤微环境,并且容易在肝脏和脾 脏等网状内皮系统(RES)聚积,严重阻碍了纳米药物载体从基础研究向临床应 用的转化[15]。在这方面,内源性的天然细胞或细胞膜因为与体细胞具有相似的细 胞膜结构,可以被机体识别为“自我(Self)”,为纳米药物载体提供了机会来隐 藏或伪装,从而削弱免疫原性和毒副作用,使其可以更加友好而安全的穿越体内 的生理屏障[16-18]。另一方面,基于天然细胞对肿瘤细胞的趋化性可以实现不同的 生物效应和靶向特异性结合,对肿瘤组织以及转移的癌细胞进行更加精确的追踪
33
定位和可控制的药物释放[19]。这些潜质使其作为一种有前景的新型药物递送策 略得到了研究学者的关注。
与其它细胞相比,巨噬细胞(MAs)作为一种吞噬细胞具有天然的吞噬能力
[20]。而且MAs具有较好的肿瘤趋向能力(Tumor-homing property),相关报道指 出,MAs可以识别肿瘤细胞分泌的细胞因子而诱导其迁移到肿瘤位置[21]。此外, MAs 表面通常具有大量过表达的 CD44 受体,利用透明质酸和 CD44 受体介导 的内吞作用可以有效增加细胞载体的药物上载量[22]。在此基础上,本章利用MAs 介导负载了聚吡咯和阿霉素的透明质酸纳米水凝胶进行抗肿瘤药物的靶向递送 研究(如图 2-1),通过体外 transwell 实验和体内皮下瘤模型考察其向肿瘤细胞 和实体瘤的靶向效果,并考察该体系对小鼠皮下瘤的联合治疗效果。
 
 
图 2-1. MAs-HA/DOX@PPy NGs (MAs-NGs) 的合成及巨噬细胞介导的肿瘤靶向递送和联合
光热治疗/化疗。
2.2实验部分
2.2.1 实验试剂
表 2-1. 主要实验试剂
试剂名称 来源
透明质酸钠(HA, Mw = 48、320、950 kDa)
吡咯(Py, 98%)
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)
胱胺二盐酸(Cys, 99%) 华熙生物科技股份有限公司
Sigma-Aldrich 中国有限公司
百灵威科技有限公司 安耐吉化学有限公司
聚乙烯醇(PVA,87-89%水解,Mw = 85-124 kDa)
34 国药集团化学试剂有限公司
 
 
 
2.2.2 材料的合成
2.2.2.1HA NGs 的制备
将不同分子量(Mw = 48、320和950 kDa)的透明质酸钠盐(HA, 20 mg) 分别溶于2 mL超纯水中,向其中加入EDC (HA:EDC = 1:0.5,摩尔比),磁力搅 拌反应3 h以活化HA上的羧基。将表面活性剂AOT预先溶于4 mL二氯甲烷 (DCM)中,然后将活化好的HA/EDC溶液在搅拌条件下逐滴加入到AOT/DCM 溶液中,搅拌10 min,形成乳白色的W/O乳液,再将该溶液逐滴滴加到预先溶 解好的PVA水溶液中,继续搅拌15 min,形成乳白色的W/O/W双乳液。最后加 入交联剂Cys反应1 h后,再用超声破碎仪在冰浴条件下超声10 min,然后敞开 瓶口在通风橱内持续搅拌过夜,以彻底挥发掉有机溶剂DCM。第二天,将HA NGs水溶液透析2天,然后13000 rpm离心5 min去掉上清,取下层沉淀重新回 溶于超纯水,即得到纯化的HA NGs溶液。
2.2.2.2HA@PPy NGs 的制备
由于分子量为950 kDa的HA黏度过大,在乳化过程中容易破乳,因此选用 了 48 kDa和320 kDa的HA NGs进行后续包载聚吡咯(PPy)的研究。称取一定 量的FeCb.6H2O (Py单体与FeCb.6H2O的比例为1吐:9 mg)溶于少量去离子 水中,将其加入到86 mg HA NGs溶液(5 mL)中搅拌1 h,此时溶液呈均一的 铁红色,然后将上述溶液置于冰浴条件下,再依次加入不同体积(10、 20、 40、 60、80 吐,换算为质量比依次为 HA NGs:Py = 1:0.11、1:0.23、1:0.46、1:0.69、 1:0.92)的吡咯Py单体,在冰浴条件下持续反应4 h,溶液由铁红色逐渐变为浅
35 绿色,然后变为深绿色。将该溶液透析 3 天并冷冻干燥,即得到负载不同比例 PPy 的 HA@PPy NGs。
2.2.2.3HA/DOX@PPy NGs 的制备
取上述优化的HA@PPy NGs负载抗癌药物DOX:称取2 mg HA@PPy NGs 溶于4 mL去离子水。称取0.5 mg盐酸阿霉素(DOX.HC1)溶于甲醇溶液,并加 入60吐三乙胺去盐酸化,然后将该DOX的甲醇溶液滴加到HA@PPy NGs水 溶液中,避光敞口搅拌过夜,挥发掉溶液中的甲醇溶剂,然后5000 rpm离心10 min,除去下层未络合的DOX沉淀,上清液即为HA/DOX@PPy NGs。向下层沉 淀中加入1 mL甲醇,溶解其中的DOX,测其在490 nm处的紫外吸收值,利用 预先绘制的DOX甲醇溶液标准曲线计算未负载上的DOX质量,然后通过差减 法得出HA/DOX@PPy NGs中DOX的上载量LCdox和封装率EEdox。
2.224 MAs-HA/DOX@PPy NGs(MAs-NGs)的制备
根据后续对MAs的细胞毒性和细胞吞噬性能研究,优化最佳的材料浓度和 吞噬时间。选取优化浓度的HA/DOX@PPy NGs,在37 oC, 5%CO2条件下与MAs 共孵育一定时间,然后消化、离心即得到负载材料的巨噬细胞 MAs- HA/DOX@PPy (记作MAs-NGs),储存于冰盒中,立即进行后续的体外/内成像 或治疗实验。
2.2.3材料表征
2.2.3.1水动力学粒径与Zeta电势分析
取1 mL的HA NGs和HA@PPy NGs(0.5 mg/mL)溶液置于石英比色皿或 电势皿中,通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)测量其水动力学直径 (Hydrodynamic size)和表面电势(Zeta电势),每个样品测量3次取其平均值。 此外,通过测量载药前/后的 HA@PPy NGs 和 HA/DOX@PPy NGs 在不同溶液 (水,PBS和含10%FBS的高糖培养基)中储存不同时间后的水动力学直径变 化,考察其胶体稳定性情况。
2.2.3.2紫外-可见吸收光谱分析
取 1 mL 的 HA NGs,HA@PPy NGs 和 HA/DOX@PPy NGs 溶液加入石英比 色皿中,放置于紫外-可见分光光度计的样品槽内进行检测,扫描波长范围为200- 1000 nm。其中,在测试前需首先用相同的溶剂样品扫描基线,以扣除溶剂影响。
2.2.3.3材料形貌表征
利用扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)观察HA@PPy NGs 和HA/DOX@PPy NGs的尺寸及形貌特征。SEM制样:取5吐 稀释好的NGs溶
36
液(0.2 mg/mL)滴在铝箔表面,在空气中自然晾干,然后将其粘贴在导电胶上 并喷金(约10 nm)处理,用于SEM测试,测试电压为5 kV。TEM制样:取5 吐NGs溶液(0.2 mg/mL)滴在铜网表面,用电烤灯烘干后用于TEM检测,TEM 加速电压为200 kV。
2.2.3.4傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析
取少量的HA原料粉末和冻干后的HA NGs、HA@PPy NGs样品,分别与溴 化钾混合后进行研磨,将研磨后的粉末压片处理用于FTIR检测,扫描范围为500- 4000 cm-1。
2.2.3.5 体外光热性能测试
配制不同浓度的 HA@PPy NGs 溶液(0.125、0.25、0.5、1 和 2 mg/mL) 各 300吐置于0.5 mL EP管中,并以等体积的超纯水作为对照。每个样品用808 nm 激光持续照射5 min,设置输出功率为1 W/cm2,通过热电偶每间隔5 s记录一次 温度变化情况。同时,我们对1 mg/mL的HA@PPy NGs溶液进行热稳定性分析, 用808 nm激光在1 W/cm2的输出功率下连续照射5个循环,每个循环先照射5 min完成升温过程,再关闭激光冷却至起始温度,如此重复5次,用热电偶记录 每次循环升降温过程。然后选取其中一个循环升温和冷却过程,通过文献中报道 的公式计算其光热转换效率[23,24]。
2.2.4体外药物释放行为研究
为了考察在不同pH和有无激光照射下DOX从NGs中的释放情况,分别配 制 pH = 7.4 的磷酸盐缓冲液和 pH = 5.5 的柠檬酸钠缓冲液,将制备的 HA/DOX@PPy NGs分散于上述不同缓冲液中配成1 mg/mL的溶液,然后各取1 mL置于截留分子量(MWCO)为10000的透析袋中,扎紧透析袋将其浸没在装 有9 mL对应缓冲液的离心管内,保持离心管内溶液的总体积为10 mL,每个样 品 3 个平行,然后分别置于 37oC 的恒温摇床中持续震荡。其中对于激光组,在 透析实验前先用功率密度为 1 W/cm2 的 808 nm 激光照射透析袋内的 HA/DOX@PPy NGs溶液10 min。在每个预设的时间点从离心管内取出1 mL缓 冲液,同时补充相应体积的缓冲液,以使离心管内的缓冲液体积保持恒定。最后 通过紫外可见分光光度计记录各时间点取出的样品在490 nm处的吸收值,并根 据free DOX在对应缓冲液下的浓度-吸光值标准曲线,计算DOX在不同时间点 累计释放的药物总量并绘制 HA/DOX@PPy NGs 在不同条件下的药物累积释放 曲线。
2.2.5细胞实验
2.2.5.1细胞培养和材料的细胞相容性评价
37
小鼠巨噬细胞(RAW264.7)和小鼠乳腺癌细胞(4T1)使用添加了 10% FBS 和1%双抗的高糖培养基(DMEM),在37 oC、5% CO2的细胞培养箱中进行培 养,1~2 天换液一次,取对数生长期的细胞进行细胞实验。其中,未经任何处理 的RAW264.7细胞表面具有高表达的CD44受体,记作RAW-HCD44细胞,而用 含有HA(2 mM)的细胞培养基预处理后,含有低水平CD44受体表达的 RAW264.7细胞,记作RAW-LCD44细胞。在没有特别说明时,本章中出现的MAs 或RAW264.7细胞均代表RAW-HCD44细胞。
利用细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒(CCK-8法)检测HA/DOX@PPy NGs 对RAW264.7细胞的细胞相容性,free DOX作为对照。将RAW264.7细胞以1X 104个/孔的密度接种在 96 孔板中培养过夜,直至孔内细胞密度达到 70%~80%。 然后去掉旧培养基,每孔加入90 pL的新鲜培养基和10吐不同浓度的 HA/DOX@PPy NGs或free DOX,使每孔中DOX的终浓度依次为5, 10, 15, 20, 30, 40和80 pg/mL,置于培养箱内孵育24 h。随后弃掉原培养基,用PBS清洗3 次,再每孔加入100 pL含10% CCK-8的无血清DMEM培养基,继续孵育2 h。 然后用多功能酶标仪测试各孔在450 nm处的吸光度(OD)值,并计算细胞存活 率。其中在实验过程中,每个浓度设置5个平行复孔,并用PBS(10 pL)处理 的细胞作为对照组。
类似地,还利用CCK-8法测定未负载纳米凝胶的MAs和负载了纳米凝胶的 MAs-NGs 在 808 nm 激光照射前后的细胞毒性,其中激光功率密度设置为 1.5 W/cm2,照射时间为5 min。
2.2.5.2巨噬细胞对载药纳米凝胶的吞噬量研究
通过 UV-vis 吸收光谱记录在 490 nm 处 DOX 的吸收值,计算不同浓度的 HA/DOX@PPy NGs( [DOX] = 10、20 或 40 pg/mL)与 RAW264.7 细胞孵育一定 时间(0、1、2、4、6或8 h)后的细胞吞噬量。首先,将1 X 105个/孔的RAW264.7 细胞接种于12孔板中并培养过夜,然后去掉旧培养基,用PBS轻洗2次。其后, 为了研究吞噬时间与吞噬量的关系,在每孔中加入1 mL含有HA/DOX@PPy NGs ([DOX] = 20 pg/mL)的无血清培养基,分别与细胞共培养1、2、4、6或8 h。 而对于浓度与吞噬量的研究,则在每孔中加入含有不同浓度HA/DOX@PPy NGs ([DOX] = 10、20或40 pg/mL)的无血清培养基,并孵育4 h。然后,将上述细 胞用 PBS 轻轻清洗 3 次,离心收集细胞并计数,先将其置于液氮中冷冻,再迅 速放入37 oC水浴锅中融化,如此反复冻融3~5次,使细胞充分裂解以释放出吞 噬的DOX。通过紫外可见分光光度计测量释放出的DOX吸收值,其中PBS处 理的细胞按照同样的方式处理以后用作对照,以扣除细胞本身的背景吸收,最后 根据预先绘制的标准曲线和细胞数量计算每个细胞中DOX的含量。
此外,我们还利用激光共聚焦显微镜(CLSM)通过观察DOX的荧光进一
38
步验证了巨噬细胞对HA/DOX@PPy NGs的吞噬。将RAW264.7细胞(1 X 105个 /皿)接种于confocal皿中并置于37 oC, 5% CO2条件下孵育过夜。然后去掉旧培 养基,每皿加入1 mL含有HA/DOX@PPy NGs的新鲜培养基([DOX] = 20 pg/mL) 孵育4 h或6 ho PBS和单独的DOX (20 pg/mL)处理的细胞作为对照。其中, DAPI 用来标记巨噬细胞的细胞核。
2.2.5.3体外巨噬细胞迁移实验
巨噬细胞 MAs 具有良好的肿瘤归巢作用。我们通过 transwell 装置考察 MAs 对NGs的吞噬(MAs-NGs)是否会影响其肿瘤趋向特性,其中未经NGs处理的 巨噬细胞(MAs)作为对照组。选用24孔Transwell板(康宁公司)进行实验, 其中transwell上室底部带有&0 pm孔径的聚碳酸酯膜。首先将4T1细胞(5X 104个/孔,0.5 mL DMEM培养基)接种于下室,在37 oC, 5% CO2条件下培养过 夜,同时,在下室中加入不含4T1细胞的空白培养基(0.5 mL/孔)作为阴性对 照。第二天,在上室中接种200 pL的MAs-NGs和MAs (2X104个/孔),然后将 上室置于下室中合并培养18 h,以完成迁移过程。随后去掉上室中的培养基,先 将细胞用PBS轻轻清洗2次,再用4%的多聚甲醛(1 mL/孔)固定15 min,然 后用PBS再次轻洗2次后,使用配置好的结晶紫溶液(0.1%, 1 mL PBS/孔)染 色30 min。之后,用PBS小心清洗2~3次以除去多余的结晶紫,并用润湿的棉 棒将上室中未迁移的细胞轻轻擦除。最后,用倒置相差显微镜观察迁移到上室底 部的MAs-NGs或MAso每组至少拍摄20张照片用于计数迁移的细胞和进行统 计学分析。
2.2.5.4巨噬细胞分型评价
为了检测HA/DOX@PPy NGs的吞噬是否会对MAs的分型产生影响,我们 利用流式细胞术分析了 MAs表面蛋白标志物的表达情况。将原代的RAW264.7 细胞(MAs)以2x105个/孔的细胞密度接种于12孔板中。同时,为了方便对比, 预先用1 pg/mL的LPS诱导的M1型巨噬细胞和由10 ng/mL的IL-4诱导的M2 型巨噬细胞也分别以2X105个/孔的密度接种于12孔板内。第二天,去掉旧培养 基,在MAs-NGs组加入含有HA/DOX@PPy NGs的新鲜培养基(1 mL/孔,[DOX] =20 pg/mL), M1、M2和MAs组则分别加入同样体积的空白培养基,继续孵育 4 h以后,收集上述细胞并重悬于1 mL PBS中。然后每管分别加入5 pL的抗体 anti-CD16/32-FITC、anti-CD11c-FITC 或 anti-CD206 Alexa Fluor® 488,置于冰下 孵育30 min后,上机进行流式细胞分析。其中,相关的同型对照也按照上述相 同的方式进行处理。
2.2.5.5MAs-NGs的体外热成像性能评价
为了考察HA/DOX@PPy NGs被MAs吞噬以后的体外光热性能,通过FLIR
39
红外热成像仪记录不同浓度的MAs-NGs细胞悬液(5X106或9 x106,0.3 mL PBS) 在1 W/cm2或1.5 W/cm2的输出功率下,用808 nm激光照射时的升温情况-MAs- NGs 通过以下方法获得:待T-25培养瓶中的MAs生长至70%~80%密度时,去 掉原培养基,加入5 mL含有HA/DOX@PPy NGs的新鲜DMEM培养基([DOX] =20 pg/mL)孵育4 h,然后用PBS清洗3次,消化、离心、收集细胞,再将其 重悬于装有0.3 mL PBS的Eppendorf离心管中备用。其中,PBS和经PBS处理 后的细胞 MAs 用作对照组。另外,在不同功率密度下用 808 nm 激光分别照射 PBS,MAs和MAs-NGs过程中,我们还使用DT-8891E热电偶实时记录每个样 品的温度变化。
2.2.5.6DOX和NGs从MAs-NGs的释放以及MAs-NGs的体外抗肿瘤效果评价
我们进一步研究了在Laser (+)或Laser (-)条件下,DOX和NG从MAs- NGs 的释放行为。首先,将MAs以2X105个/孔的细胞密度接种于12-孔板中并 在37 oC, 5% CO2条件下孵育过夜。第二天,每孔更换含有HA/DOX@PPy NGs ([DOX] = 20 pg/mL)的新鲜培养基,继续孵育4 h,然后去掉培养基,用PBS 清洗2次,即得到MAs-NGs。此时,取其中3个孔进行消化、离心、计数并取 其平均值,以确认每孔中 MAs-NGs 的细胞数量。然后,向其余每孔加入 1 mL PBS,其中对于MAs-NGs + L组,用808 nm激光在1.5 W/cm2的功率密度下预 先照射细胞5 min,然后将其置于培养箱中继续孵育。之后,在设定好的时间点 (0.5、1、2、4、6和12 h)分别取1 mL培养液用于UV-vis测试,随后再补充 1 mL PBS/孔。最后,通过UV-vis吸收光谱记录在490 nm和808 nm处的吸收值 定量DOX和HA/DOX@PPy NGs的累积释放量。
利用12-孔transwell装置来评价在NIR Laser (+)或Laser (-)条件下,MAs- NGs 对4T1细胞的体外治疗效果。首先,将4T1细胞以2.5 X104个/孔的密度接 种于 transwell 上室并用全培养基进行培养。将用 HA/DOX@PPy NGs([DOX] = 20 pg/mL)预先处理4 h得到的MAs-NGs以1 X 106个/孔的细胞密度接种于下室 中,然后将上室与下室合并培养12、24或48 h。其中,对于MAs + L to 4T1组 和MAs + L to 4T1 + L组,MAs和/或4T1细胞分别用808 nm激光在1.5 W/cm2 的功率密度下预先照射5 min。DMEM和MAs组作为对照组。上室与下室共同 培养一定时间以后,将上室转移到一个新的12孔板内,上室中的4T1细胞用PBS 清洗3次,加入100 pL含有10% CCK-8的无血清培养基继续孵育3 h。然后, 我们将该上清液转移到96孔板中,置于酶标仪上测试每个孔在450 nm处的吸 收值。
2.2.6动物模型
4-6 周的雌性裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司(中国上海),在无特定
40
病原体(specific-pathogen free, SPF)的动物房内饲育,保持恒温(20 -26和 恒湿(50 %-65 %)条件。饲料、垫料、笼具及饮水等物品均经高压蒸汽灭菌, 并适时更换。所有动物实验均经东华大学动物伦理委员会批准,并按照国家卫生 部的政策施行。建立4T1皮下瘤模型用于体内成像或体内治疗研究,在每只小鼠 右侧后腿上方的背部,皮下接种100 pL含有2X106个4T1细胞的无菌生理盐水 细胞重悬液,接种7-10天后,当肿瘤体积达到80-100 mm3时用于后续的成像和 治疗实验。
2.2.7体内荧光成像
我们利用小动物荧光成像仪观察细胞膜染料 DiR (1,1-dioctadecyl-3,3,3,3- tetramethylindotricarbocyaine iodide)标记的 MAs 和 MAs-NGs 在荷瘤小鼠体内的 分布情况,以确认载药前后的MAs和MAs-NGs在体内的肿瘤归巢特性。每只 小鼠注射100 pL含有5X106个MAs或MAs-NGs的无菌PBS细胞重悬液,在 注射前(0h)和注射后不同时间点(2、8、24、48 h)分别通过带有CCD相机 的活体荧光成像系统(IVIS)记录其荧光成像情况。同时,Cy7-NH2标记的 HA/DOX@PPy NGs (2.23 mg/mL, [DOX] = 429 pg/mL, 100 pL PBS)用作对照组。 每只小鼠在注射前均通过腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)进行麻醉。此外,为 了研究不同材料在体内的荧光信号生物分布,在荧光成像后 48 小时将各组小鼠 安乐死,取心、肝、脾、肺、肾等主要器官和肿瘤组织进行体外荧光成像。使用 IVIS成像软件采集和分析选定区域(ROI)的所有荧光成像数据。
2.2.8体内肿瘤热成像
通过红外摄像机验证MAs-NGs在皮下肿瘤模型体内的光热成像性能。简言 之,将 MAs 与 HA/DOX@PPy NGs ([DOX] = 20 pg/mL)孵育 4 h 后,收集 5 X 106个MAs-NGs分散在100 pL PBS中,然后通过尾静脉注射到小鼠体内。没有 负载NGs的MAs (5x106个细胞,在100 pL PBS中)和含有同样质量的 HA/DOX@PPy NGs (2.23 mg/mL, [DOX] = 429 pg/mL,在 100 pL PBS 中)也分 别静脉注射到小鼠体内,作为对照组。在肿瘤区域用808 nm激光在1.5 W/cm2的 功率密度下照射5 min后,记录每只小鼠的热成像过程和相应的温度变化。
2.2.9 体内抗肿瘤治疗
当肿瘤体积达到约100 mm3时,开始进行体内抗肿瘤治疗。将荷载4T1皮 下瘤的裸鼠随机分为 5 组( 5 只 /组): PBS、 free DOX、 MAs-NGs 、 HA/DOX@PPyNGs + L和MAs NGs + L组。第一次注射治疗的时间记作第0天, 分别在第0天、第4天和第8天给每只小鼠静脉注射PBS ( 100 pL)、free DOX (429 pg/mL,溶于 100 pL PBS 中)、MAs NGs(5x106个细胞,[DOX] = 429 pg/mL,
41
分散在 100 pL PBS 中)、HA/DOX@PPyNGs + L(2.23 mg/mL, [DOX] = 429 pg/mL, 溶于100 pL PBS中)或MAs NGs + L,共计治疗3次。在每次治疗中,各组注 射的DOX剂量保持一致,为每只小鼠42.9 pg (即每只小鼠1.95 mg/kg DOX), 这显著高于文献中报道的最低有效注射剂量(1 mg/kg) [21]。其中,对于MAs-NGs 和MAs-NGs + L组,分别尾静脉注射100 pL含有5 X 106个细胞的无菌PBS细 胞重悬液。对于HA/DOX@PPyNGs + L和MAs NGs + L组,分别在注射后2小 时和24小时用808 nm激光(1.5 W/cm2, 5分钟)照射每只小鼠的肿瘤部位,以 进行光热治疗(PTT)。治疗过程中每隔一天监测每只小鼠的肿瘤体积和体重变 化,直到第15天治疗结束。在第15天,每组随机处死一只小鼠,取其肿瘤组织 依次进行蜡块包埋、切片、H&E (Hematoxylin-eosin staining,苏木精-伊红)和 TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色。其余的小鼠则用于记录 小鼠存活率。肿瘤体积(V)按照下列公式计算:V= a x b2/2,其中a为肿瘤长 度, b 为宽度。
2.2.10 体内生物安全性评价
首先,为了检查小鼠的组织学变化,在治疗后第15天,从上述每组处死的 小鼠中获取心、肝、脾、肺和肾等主要器官,用4%的多聚甲醛固定、石蜡包埋 后,切片并进行 H&E 染色。之后,通过倒置光学显微镜(日本东京尼康公司) 观察样本的组织形态。
随后,为了研究MAs或MAs-NGs是否会对正常裸鼠产生系统毒性,在用 PBS、MAs (5x106个细胞)或MAs-NGs (5x106个细胞)治疗后第7天,对小鼠 实施安乐死,并采集全血(n=3)。然后将血液样本在4000 rpm转速下离心15分 钟以制备血清样本,获得的血清储存在-80°C下,以进行生化分析和炎症相关细 胞因子的定量测试。肝功能(丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)) 和肾功能指标(尿素氮(BUN)、血清肌酐(CREA)指标通过生化分析仪(中国 深圳雷托Chemray 800)进行测定。炎症细胞因子如白细胞介素-6(IL-6)、IL-12、 干扰素-Y (IFN-y)和肿瘤坏死因子-a (TNF-a)通过ELLSA进行分析。
2.2.11 统计学分析
实验数据均以平均值土标准差(Mean 土 SD)表示(nN 3)。采用单因素方 差分析法(One-Way ANOVA)评价各组间实验数据的显著性差异。选择0.05 作为显著性水平,所有显著性差异分别标记为:(*)表示p < 0.05, (**)表示 p < 0.01, (***)表示 p < 0.001。
2.3结果与讨论
2.3.1HA/DOX@PPy NGs的合成与表征
42
根据前期文献报道[25,26],为了合成HA/DOX@PPy NGs,首先利用双乳化 (W/O/W)法制备得到了 HA NGs,然后分别通过原位氧化聚合法和物理包覆法 在其内部负载带正电荷的聚吡咯PPy和抗肿瘤药物DOX。我们选用了不同分子 量的透明质酸钠(Mw = 48、320或950 kDa)来制备HA NGs,以研究HA分子 量对后续PPy负载量和稳定性的影响。首先,通过DLS测试制备的HA NGs、 HA@PPy NGs和HA/DOX@PPy NGs。不同分子量的透明质酸制备得到的HA NGs的水合粒径和电势变化情况如表2-2所示,随着HA分子量的增加(48、320 和950 kDa),制备得到的HA NGs的水动力学粒径呈增加趋势,从243.8 土 3.45 nm分别增加到316.7 土 11.66 nm和383.0 土 5.86 nm,表面电势也略有升高。但是 在制备HA NGs的过程中发现,当HA的分子量达到950 kDa时,由于其黏度较 大,在W/O/W乳化过程中容易发生破乳现象。于是选取了 48 kDa和320 kDa的 HA NGs进行后续PPy负载量的研究。
表2-2.利用不同分子量的HA通过双乳化法制备的HA NGs的水动力学粒径、表面电势和 PDI
Molecule weight of
HA (kD) Hydrodynamic size (nm) Zeta potential (mV) PDI
48 243.8 士 3.4 -7.9 士 0.5 0.49 土 0.48
320 316.7 土 11.7 -4.5 土 0.2 0.25 土 0.06
950 383.0 土 5.9 - 4.2 土 0.3 0.22 土 0.03
 
表2-3.不同PPy上载量的HA@PPy NGs的水动力学粒径、表面电势和PDI
Samples HA/Py mass ratio Hydrodynamic size (nm) Zeta potential (mV) PDI
1: 0.11 193.1 土 3.0 -2.9 士 0.3 0.11 士 0.06
HA@PPy NGs 1: 0.23 154.8 土 8.1 4.6 土 0.5 0.15 土 0.04
MwHA = 48 kDa 1: 0.46 128.8 土 3.9 10.6 土 0.7 0.12 士 0.03
1: 0.69 141.1 土 1.9 7.8 土 0.4 0.09 士 0.06
1: 0.92 276.5 土 20.2 23.9 土 0.4 1.00 士 0.00
 
1: 0.11 329.9 士 18.9 1.8 士 0.1 0.29 士 0.04
HA@PPy NGs 1: 0.23 248.5 士 8.1 6.9 士 0.5 0.20 士 0.02
MwHA = 320 1: 0.46 198.1 士 4.9 9.7 士 0.4 0.02 士 0.02
kDa 1: 0.69 292.9 士 19.9 10.6 士 0.6 0.15 士 0.04
1: 0.92 412.5 士 14.3 13.9 士 0.5 0.21 士 0.02
 
随着 Py 吡咯单体投料质量比(HA:Py = 1:0.11、1:0.23、1:0.46、1:0.69、1:0.92) 的增加,制备的HA@PPy NGs的水动力学粒径和电势变化结果如表2-3和图2- 2B-C 所示,其水动力学粒径均呈先减小后增加的趋势,这可能是因为外层的 HA
NGs带负电荷,而内层包裹的PPy则带正电荷,由于静电吸引作用,开始时随着
带正电的 PPy 负载量的增加会使外层的 HA NGs 发生一定程度的收缩。而当 HA:Py21:0.46时,静电吸引作用发挥到极限,继续增加PPy会由于其粒径增大 而使HA NGs发生膨胀,从而使HA@PPy NGs的水动力学粒径也逐渐增加。如 表2-3和图2-2D, HA@PPy NGs的表面电势随Py投料比的增加而逐渐增加,表 明PPy的负载量随之增加。另外,图2-2E为不同Py投料比条件下制备的HA@PPy NGs的紫外-可见吸收光谱图,在800 nm附近的近红外光区观察到了 PPy的特 征吸收峰,显示了 PPy的成功负载,而且我们清楚地看到,随着Py投料比的增
 
图2-2. HA@PPy NGs的合成路线示意图(A)。用不同分子量的HA制备的不同Py上载量
的HA@PPy NGs的水动力学粒径(B-C)和表面电势变化(D)。HA@PPy NGs (Mwha =
320 kDa)在不同 Py 上载量时的 UV-vis 吸收光谱(E)。HA@PPy NGs (Mwha = 320 kDa,
HA:Py = 1:0.46,质量比)在不同溶液中的水合粒径变化(F), HA NGs和HA@PPy NGs
的TGA曲线(G)。
但是,我们发现用分子量为48 kDa的HA合成的HA NGs,当投料比Py/HA
44
 
> 0.46时出现了轻微的沉淀,而且冻干以后难以回溶。而用分子量为320 kDa的 HA合成的HA NGs,当投料比Py/HA = 0.46时,得到的HA@PPy NGs具有良好 的回溶性,将其分散于超纯水、PBS和含10%FBS的DMEM培养基中存放5天 后,仍未出现明显的聚沉现象,表现出优异的稳定性和再分散性(图2-2F)o这 说明分子量的增加有利于使HA NGs负载更多的PPy,以提高光热转换效率和光 热治疗效果。但是 PPy 负载量过高会使冻干以后的 HA@PPy NGs 回溶性较差, 因此我们最终选用了分子量为320 kDa的HA NGs和Py/HA = 0.46的投料比作 为最佳反应条件来制备HA@PPy NGs,以进行后续的实验研究。
 
利用不同的表征手段对上述优化的 HA@PPy NGs(MwHA = 350 kDa, HA:Py =1:0.46,下同)进行表征。TGA热重分析结果(图2-2G)显示,HA@PPy NGs 在 800 oC 下的失重率为 81.1%,而 HA NGs 为 93.8%,于是通过差减法得出 HA@PPy NGs 中 PPy 的负载量为 12.7%。如图 2-3A-B 为 HA@PPy NGs 的 SEM、 TEM照片和对应的粒径分布柱状图。从图中看到HA@PPy NGs呈均匀分布的球 形形貌,具有良好的分散性,经统计其平均粒径分别为77.3 士 9.40 nm(SEM) 和74.9 土 6.84 nm (TEM)。其中,TEM测量的NGs的平均粒径比SEM测得的 平均尺寸偏小,可能是由于二者的制样方式不同(SEM在制样时需要喷金处理, TEM则不需要)。同时,我们注意到SEM和TEM测得的HA@PPy NGs的尺寸
45 显著小于上述DLS测量的水动力学粒径尺寸(198.1 土 4.91 nm),这可能是由于 SEM和TEM测量的是干燥状态的NGs样品,而DLS测量的是充满水分子的膨 胀状态的NGs。随后,为了验证HA@PPy NGs的结构和组成,我们利用FTIR对 HA, HA NGs和HA@PPy NGs进行了表征,结果如图2-3C所示。与单独的HA 相比,HA NGs和HA@PPy NGs在1619 cm-1和1450 cm-1处的吸收带分别为- COO-的反对称(Vas)和对称伸缩振动(Vs),而且在形成NGs后其峰值强度显著 降低[27], 1151 和 1085 cm-1 处的吸收带则与多糖中伯醇的伸缩振动有关[28]。在 3432 cm-1处出现的宽重叠带应归因于HA的O-H对称伸缩振动(vs)或PPy的 典型N-H伸缩振动(vs)。另外,负载了 PPy的HA@PPy NGs出现了一些新的 条带,其中,881和796 cm-1处的吸收带为PPy环中=C-H的平面外振动[29,30]。 上述结果表明,PPy成功负载到了 HA NGs内部。
由于HA@PPy NGs在近红外光区(600-1000 nm)具有比较宽的吸收峰,于 是我们考察了 HA@PPy NGs的体外光热性能,结果如图2-3D-F所示。图2-3D 为不同浓度(0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL) 的 HA@PPy NGs 在 808 nm 激光 照射下的升温情况,显然,在一定的功率密度(1 W/cm2)下,HA@PPy NGs的 升温效应随着浓度的增加逐渐增加,温度变化(AT)可以从6.7 oC(0.125 mg/mL) 增加到20.2 oC (2 mg/mL)o其中当浓度为1 mg/mL时,HA@PPy NGs的温度升 高了 18.8 oC,而纯水仅增加了 0.2 oC。随后,通过五次循环升降温过程测试了 HA@PPy NGs ( 1 mg/mL)的光热稳定性,其中用808 nm激光照射5 min完成一 个升温过程,然后关闭激光冷却至起始温度,完成一个降温过程,结果如图 2-3E 所示,发现五个循环之间的温度变化没有出现明显差异,表明制备的 HA@PPy NGs具有良好的光热稳定性。另外,根据图2-3E中的升温冷却曲线,得到图2- 3F 冷却时间与驱动温度的自然对数的相反数之间的关系,经线性拟合可知 HA@PPy NGs的热传递系数为149 s,根据公式[31 ]计算出其光热转换效率为 52.7%,显著高于一些文献中报道的无机纳米颗粒[32,33]。因此HA@PPy NGs可以 有效地将近红外激光能量转换为热能,可以作为潜在的光热试剂用于光热治疗。
由此可见,制备的 HA@PPy NGs 具有粒径分布均匀、胶体稳定性好、光热 转换效率高等优点,可以用于负载抗癌药物DOX。为了降低DOX对细胞载体 MAs的潜在细胞毒性,我们选择NG/DOX质量比为1:0.25的比例进行DOX负 载。首先,通过UV-vis光谱确认NGs上DOX的负载情况(图2-4A),与不含 DOX 的 HA NGs 和 HA@PPy NGs 相比,HA/DOX@PPy NGs 在 490 nm 处显示 出了典型的DOX吸收峰,表明DOX已成功上载到了 NGs上。经计算,其药物 包封率(EE%)和载药量(LC%)分别为95.0%和19.2%。此外,值得注意的是, 通过记录HA/DOX@PPy NGs在不同介质(水,PBS,含10% FBS的DMEM培 养基)中存放5天过程中的流体力学尺寸(图2-4B),证明负载了药物的NGs仍
46
 
具有良好的稳定性。另外,如图2-4C所示,与未负载DOX的HA@PPy NGs(74.9 土 6.84nm)相比,HA/DOX@PPy NGs 的 TEM 尺寸略微增大至 77.2 土 9.68 nm (图 S8),进一步表明NGs内药物的成功负载。
 
图 2-4. HA NGs, HA@PPy NGs 和 HA/DOX@PPy NGs (Mwha=320 kDa, HA:Py =1:0.46)
的UV-vis吸收光谱(A); HA/DOX@PPy NGs在水、PBS或含10% FBS的DMEM培养基
中储存5天过程中的水动力学粒径变化(B); HA/DOX@PPy NGs的TEM照片和粒径分布
柱状图(C),及其在不同条件下的药物释放曲线(D)。
以 pH = 5.0的柠檬酸缓冲液和 pH = 7.4 的磷酸盐缓冲液作为缓释媒介,考 察了 DOX在不同pH环境下从HA/DOX@PPy NGs中的释放行为。据报道,经 静脉注射后,使大多数MAs迁移到发炎的肿瘤组织通常需要6-12 h的时间[21,34]。 因此,我们希望负载了 NP的MAs在运输过程中的最初几个小时内具有最小的 药物释放,并在到达肿瘤部位后进行充分的药物释放。如图 2-4D 所示,在 6 h 时,HA/DOX@PPy NGs在pH = 7.4条件下仅累积释放出13.6%的DOX, 在 pH =5.5时累积释放了 30.9%的DOX,这有利于降低其对MAs细胞载体的毒副作 用。而在72 h时,DOX的累积释放量在pH = 7.4条件下达到21%,在pH = 5.5 下达到52.4%, DOX在微酸性条件下的快速释放应归因于质子化以后DOX的水 溶性增加所致,这与文献报道[35]相一致,然而此时,仍有近一半的DOX无法释 放。但是在pH = 5.5,并把HA/DOX@PPy NGs暴露于808 nm激光下照射10 min 后,DOX的释放量大大增加至87%。这可能是由于近红外激光照射产生的热能
47
可以触发和加速DOX从HA/DOX@PPy NGs的释放卩4,36,37】。这意味着在酸性肿 瘤微环境条件下,用近红外激光照射肿瘤部位可以控制和促进药物的释放,有利 于降低其对正常组织的毒性作用,提高抗肿瘤治疗效果。
2.3.2细胞相容性和细胞吞噬量研究
为了优化合适浓度的HA/DOX@PPy NGs以将其装载到MAs中,利用CCK- 8细胞毒性实验考察了不同浓度的HA/DOX@PPy NGs与MAs孵育24小时后的 细胞活力情况,相同浓度的free DOX作为对照组,结果如图2-5A所示。从CCK- 8结果看到,free DOX在5 pg/mL浓度下即对巨噬细胞MAs产生了明显的毒性 作用,细胞存活率急剧下降至< 20%。而载药纳米凝胶HA/DOX@PPy NGs在 DOX浓度为20 pg/mL时,可以使MAs的细胞活力维持在80%以上,当DOX浓 度升高至 40 pg/mL 时,其存活率仍保持在 70.4%。这说明负载了 DOX 的 HA/DOX@PPy NGs可以控制药物进行缓慢释放,有利于后续MAs对DOX的负 载及其携带药物向肿瘤位置的特异性输送。
 
图2-5. CCK-8法测得的经HA/DOX@PPy NGs或free DOX处理24 h后的MAs细胞活力
(A); HA/DOX@PPy NGs ([DOX] = 20 pg/mL)与 MAs 孵育不同时间后的 DOX 吞噬量
(B),及不同浓度的NGs与MAs孵育4 h以后的DOX吞噬量(D) ,D中嵌入的图片为载
药前后的 MAs 和 MAs-NGs 照片。
根据上述细胞活力分析,我们选取[DOX] < 40 pg/mL的HA/DOX@PPy NGs 来研究其在不同浓度和不同孵育时间下在 MAs 内的负载能力。将不同浓度 ([DOX]=10、20 或 40 pg/mL)的 HA/DOX@PPy NGs 与 MAs 孵育不同时间(1、 2、4、6或8 h)。然后,收集MAs-NGs并进行计数,通过反复冻融法将细胞破 碎,以使其完全释放出吞噬的HA/DOX@PPy NGs,通过UV-vis吸收光谱测定 490 nm 处 DOX 的吸收值定量 NGs 的吞噬量。如图 2-5B 所示, HA/DOX@PPy NGs ([DOX]= 20 pg/mL)与MAs共孵育4 h后,细胞内DOX的摄取量明显增 加至&58 pg/个细胞,延长培养时间至8 h后,每个细胞内的DOX摄取量略微增 加至9.03 pg。同时,我们还发现NGs的摄取量随着浓度的增加而增加,在[DOX] =40 pg/mL时,每个MAs-NGs细胞内DOX的摄取量可达到11.07 pg(图2-5C)。 另外,从收集的MAs-NGs明显的颜色变化也验证了 HA/DOX@PPy NGs成功装
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载到了 MAs中(图2-5C)o基于上述研究结果,我们选择[DOX] = 20昭/mL的 HA/DOX@PPy NGs 与 MAs 孵育 4 h 来制备 MAs-NGs 用于后续的研究。
基于HA/DOX@PPy NGs中DOX的荧光作用,我们还使用CLSM定性分析 了 MAs对NGs的吞噬行为。如图2-6A所示,与4 h相比,HA/DOX@PPy NGs 与MAs孵育12 h以后,在细胞质内观察到了增强的DOX荧光。但是我们发现, HA/DOX@PPy NGs组的DOX荧光强度均显著低于free DOX组,为了寻找其中 的原因,我们利用荧光光谱分析、比较了载药前后DOX荧光强度的变化(图2- 6B),相同浓度(1 mg/mL) 的 free DOX作为对照。显然,与free DOX相比, 负载到HA@PPy NGs上的DOX发生了显著的荧光猝灭,这可能是由于负载到 NGs内的DOX相互聚集所致。由此,可以合理地解释MAs在与载药纳米凝胶 孵育4 h和12 h后显示出较弱荧光的原因,这也与文献报道一致[30]。
 
图 2-6. MAs 经 HA/DOX@PPy NGs ([DOX] = 20 昭/mL)处理 4 h 或 12 h 后的 CLSM 照片
(A),其中用 PBS 和 free DOX 处理 4 h 的 MAs 用作对照组(Scale bar = 20 gm)。Free
DOX和HA/DOX@PPy NGs的荧光光谱图(B)。
据报道,MAs细胞表面具有高表达的CD44受体,从而可以与HA特异性结 合[38,39]。为了确认通过 CD44 受体介导的内吞作用是否可以增加 MAs 对
HA/DOX@PPy NGs的吞噬,分别将具有高水平CD44受体的RAW-HCD44细胞 和低水平CD44受体的RAW-LCD44细胞(经2 mM HA预处理的 MAs)与 HA/DOX@PPy NGs共培养4 h,然后利用流式细胞仪分析MAs细胞内的荧光强 度。如图2-7A-B所示,与经HA预处理的RAW-LCD44细胞相比,RAW-HCD44 细胞在不同DOX浓度下均显示出显著增加的DOX荧光强度(p < 0.001),表明 CD44受体可以介导MAs增加对HA/DOX@PPy NGs的吞噬[40,41]。
49
 
 
图 2-7. RAW-LCD44 (HA-blocked)细胞和 RAW-HCD44 细胞经不同浓度的 HA/DOX@PPy
NGs处理4 h以后的流式细胞检测结果(A)及对应的荧光强度定量分析(B)。
2.3.3 Transwell迁移和巨噬细胞分型评价
我们接下来考察了 HA/DOX@PPy NGs的负载是否会影响MAs载体细胞固 有的肿瘤归巢特性和细胞分型情况。首先,如图2-8A为transwell迁移实验设计 示意图,与MAs相比,分析负载了载药纳米凝胶的MAs-NGs向4T1肿瘤细胞 的迁移特性是否发生改变。从图2-8B的统计分析结果看到,MAs-NGs与未负载 NGs的MAs显示出了相当的细胞迁移百分数(43%对45%)。这从相差显微镜观 察到的经结晶紫染色后下室中的细胞数量图片也可以看出,在 4T1 细胞的诱导 下,二者均可以穿过上室的聚碳酸酯膜,有效地迁移到下室中(图2-8C和2-8E)。 与之相反,当下室中没有4T1细胞时,在图2-8D和2-8F中仅观察到少量MAs (10.2%)或 MAs-NGs (9.2%)。这表明 HA/DOX@PPy NGs 的负载,未对 MAs- NGs 的肿瘤归巢特性产生明显影响。
 
图2-8. Transwell迁移实验示意图(A),细胞迁移百分数(B)和通过倒置相差显微镜观察
到的穿过聚碳酸酯膜到达下室的巨噬细胞数目情况(C-F)。其中未负载材料的巨噬细胞
(MAs)和装载了 HA/DOX@PPy NGs的巨噬细胞(MAs-NGs)分别接种于上室,4T1细
胞或空白培养基分别置于下室中,孵育时间为18也图(C-F)中Scale bar =100 pm。
50
 
为了研究 NGs 的负载是否影响 MAs 的分型,利用流式细胞术分析了 MAs 表面蛋白标志物(CD16/32、CD11c和CD206)的表达。巨噬细胞一般分为经典 活化的 M1 型(Classically activated M1-type)和替代性活化的 M2 型(Alternatively activated M2-type)[42]。 M1 型巨噬细胞可以通过分泌促炎性细胞因子和趋化因子 抑制肿瘤的生长,而M2型巨噬细胞通过分泌抑制性细胞因子参与肿瘤的进展和 转移。CD16/32和CD11c在M1型巨噬细胞表面高度表达,而CD206在M2型 巨噬细胞表面过度表达[43,44]。在此,使用LPS (Igg/mL)刺激的M1型巨噬细胞 和用IL-4 (10 ng/mL)诱导的M2型巨噬细胞用作阳性对照组,同型对照处理的 细胞用作阴性对照组。如图 2-9A-B 为流式细胞分析结果, MAs-NGs 与 MAs 表 面的 CD16/32(67.4 士 0.21 vs 62.3 士 1.47)、CD11c(17.8 士 0.24 vs 16.3 士 0.16)和 CD206(12.4 士 3.63 vs 13.9 士 1.24)的蛋白表达均非常接近,未发现显著的变化。 而且值得注意的是,所有表面蛋白标志物的表达水平都远低于阳性对照组(M1 型或M2型,p < 0.01)o这说明HA/DOX@PPy NGs的负载没有对MAs载体细
 
2.3.4 MAs-NGs的体外光热性能分析
为了确认MAs-NGs的光热特性,我们分析了不同数量的MAs-NGs细胞悬 液 (5 x 106和9 x 106个,重悬于200 gL PBS),在不同功率密度下(1 W/cm2或 1.5 W/cm2)用激光辐照300 s过程中的热成像和光热升温效果(图2-10A-C)。相 同数量的MAs细胞悬液(5x106或9x106个,200 gL PBS)和PBS溶液(200 gL) 作为对照。显然,在功率密度为1 W/cm2时,含有9x106个细胞的MAs-NGs悬 浮液温度升高了(AT) 11.6 °C (图2-10B),而在激光功率密度为1.5 W/cm2时
51
 
AT值增加到了 26.7 °C (图2-10C)。同时,含有5x106个细胞的MAs-NGs悬浮 液,其AT值在1 W/cm2时仅为3C (图2-10B),而在1.5 W/cm2时可以显著增 加至14.6 C (图2-10C)。上述结果表明,MAs-NGs在激光照射过程中的温度变 化与细胞数目和激光功率密度密切相关。值得注意地是,与MAs-NGs相比,MAs 和PBS对照组在相同条件下没有显示出明显的温度升高,说明MAs-NGs的升温 特性主要来自于HA/DOX@PPy NGs的负载。此外,通过观察相应样品在不同激 光功率密度(1 W/cm2或1.5 W/cm2)下的红外热成像照片(图2-10A),显示了 与上述结果一致的光热升温特点。 MAs-NGs 优越的体外光热性能表明, HA/DOX@PPy NGs 在 MAs 中的成功负载可赋予其优异的光热升温能力,以用 于进一步的抗肿瘤光热治疗。
 
图2-10.不同数量的MAs和MAs NGs (5X106或9X106)在808 nm激光、不同功率密度 下照射5 min时的体外光热成像(A)和温度变化情况(1 W/cm2 (B), 1.5 W/cm2 (C))。
2.3.5 DOX和NG从MAs-NGs的释放以及MAs-NGs的体外抗肿瘤效果评价
通过记录在490和808 nm处的UV-vis吸收值来评估DOX和HA/DOX@PPy NGs 在存在或不存在 NIR 激光时从 MAs-NGs 的药物释放行为(图 2-11A-C)。 如图2-11B-C所示,DOX和HA/DOX@PPy NGs的累积释放量随着孵育时间的 延长而增加,而且施加近红外激光可以显著促进这DOX和NGs的释放。在观测 时间内(12 h),没有NIR激光情况下,经计算只有16.5%的DOX和15.5%的 HA/DOX@PPy NGs 从 MAs-NGs 中释放出来,这表明 DOX 和 NGs 从细胞载体 中的释放速度十分有限。然而,当用808 nm激光在1.5 W/cm2条件下照射5分 钟后,DOX和NGs的释放量在12 h内显著增加到了 43.8%和33%。近红外激光 诱导的快速释放可能是由于光热作用导致 MAs-NGs 发生了热损伤所致。于是, 我们验证了使用或不使用NIR激光条件下MAs-NGs的细胞活力情况(图2-12)。 与其他组相比,用1.5 W/cm2的808 nm激光照射5 min后,MAs-NGs + L组的 细胞活力显著下降(p < 0.001),该结果与上述猜想一致。此外,我们还发现DOX 的累积释放量略高于HA/DOX@PPy NGs,这可能归因于近红外激光同时也会促 进 DOX 从 NGs 的释放。
52
 
 
图2-11. DOX和NGs从MAs-NGs中进行释放的实验设计示意图,将MAs-NGs在激光存
在(MAs-NGs + L)或不存在情况下与PBS进行孵育(A)。DOX (B)和HA/DOX@PPy
NGs (C)的累积释放曲线。利用transwell实验分析4T1细胞的细胞活力示意图(D),利
用不同材料及是否激光条件下分别处理12 h (E)、24 h (F)和48 h (G)后测试4T1细胞
的活力, *** p < 0.001。
我们还利用 CCK-8 法分析了 MAs-NGs 对 4T1 细胞的体外抗肿瘤效果(图
2-11D-F),分为以下几组:第1组,DMEM组(control组);第2组,MAs组; 第3组,MAs-NGs组(化疗组);第4组,MAs-NGs + L组(NIR激光促进化疗 组);第5组,MAs-NGs + L/4T1 + L组(NIR激光促进化疗+ PTT组)。从图2- 11E-F看到,与其他组相比,MAs-NGs + L/4T1 + L组孵育12 h后的4T1细胞存 活率明显降低,但仍然高于80%,而在孵育24 h后,其细胞活力显著下降至57.4%o 值得注意地是,治疗48 h后,3-5组的4T1细胞存活率均显著低于DMEM对照 组和MAs组(p < 0.001)(图2-11G)o因此,体外抗肿瘤效果的顺序依次为MAs- NGs + L/4T1 + L > MAs-NGs + L/4T1 > MAs-NGs > MAs > DMEM,该结果表明 NIR激光不仅可以促进DOX从MAs-NGs中的释放,还能产生显著的光热/化疗
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图 2-12.存在(+L)或不存在激光(808 nm, 1.5 W/cm2, 5 min)照射时,MAs 和 MAs-NGs 培养24 h后的细胞活力情况。
2.3.6 MAs-NGs向体内肿瘤模型的递送
为了验证MAs是否可以将HA/DOX@PPy NGs有效递送到肿瘤位置,我们 用细胞膜染料DiR对MAs和MAs-NGs进行染色,然后用小动物荧光成像仪监 测静脉注射后的MAs和MAs-NGs在4T1荷瘤小鼠中的荧光分布情况。Cy7标 记的HA/DOX@PPy NGs作为对照组。如图2-13A所示,注射后2 h即在Cy7- HA/DOX@PPy NGs组的小鼠肿瘤位置观察到了最高的Cy7荧光信号值,随后逐 渐降低。与之不同地是,经MAs或MAs-NGs处理的小鼠,在注射后8 h才在其 肿瘤位置处观测到明显的DiR荧光信号,并在24 h达到最大荧光强度,肿瘤位 置处的荧光信号可以维持到48 h。这表明,通过MAs肿瘤归巢作用介导的药物 递送,可以使载药纳米凝胶在肿瘤区域维持较长时间的聚积,这将有利于进一步 改善抗肿瘤治疗效果。
我们在注射后 48 h 对小鼠实施安乐死,并收集其主要器官和肿瘤组织进行 体外荧光成像,以研究Cy7-HA/DOX@PPy NGs、MAs和MAs NGs在各组织器 官中的生物分布情况(图2-13B)。值得注意地是,MAs-NGs与未负载NGs的 MAs 显示出相近的肿瘤靶向能力, MAs 和 MAs-NGs 均主要分布在肿瘤、肝脏 和脾脏中。同时,为了更准确的比较各组材料在肿瘤位置的聚积能力,我们还定 量分析了 tumor/liver的荧光比值(图2-13C)。显然,MAs组和MAs-NGs组的 tumor/liver荧光比值显著高于NGs组(p < 0.01)。这也证明,通过MAs介导的 肿瘤归巢作用可以使NGs更易于逃离网状内皮系统的拦截,从而改善肿瘤治疗。
54
 
 
图2-13.静脉注射HA/DOX@PPy NGs、MAs或MAs-NGs前后不同时间点的4T1荷瘤裸
鼠体内荧光图像(A),以及注射后48小时主要器官和肿瘤组织的体外荧光图像(B)和对
应的 tumor/liver 比值(C) (**p < 0.01)。静脉注射不同材料(PBS, MAs, HA/DOX@PPy
NGs或MAs-NGs)前后的荷瘤裸鼠,用1.5 W/cm2的808 nm激光下照射肿瘤5 min过程中
的体内热成像照片(D)和对应的温度变化曲线(E)
2.3.7 体内热成像性能分析
我们将不同处理(PBS、MAs、HA/DOX@PPy NGs 或 MAs NGs)后的 4T1 荷瘤裸鼠,用1.5 W/cm2的808 nm激光持续照射肿瘤5 min,以研究其体内光热 成像性能(图2-13D-E)o可以看出,与其他组相比,MAs-NGs组的小鼠肿瘤位 置显示出了最显著的热成像对比效果,表明MAs-NGs保持了良好的肿瘤归巢能 力。用808 nm激光在1.5 W/cm2下照射肿瘤5 min后,经MAs-NGs处理的小鼠 肿瘤部位温度升高了 13 C,而经PBS和MAs处理的小鼠肿瘤温度仅略有升高, 分别为5.1 C和6.9 C。此外,直接注射HA/DOX@PPy NGs的小鼠,其肿瘤位 置的温度升高了 8.6 C,也远低于MAs-NGs组,这是由于NGs本身缺乏肿瘤归 巢作用所致。
55
 
 
2.3.8 体内抗肿瘤治疗效果评价
基于其固有的吞噬性能和肿瘤归巢特性, MAs 被认为是一种可以用于实体 瘤靶向给药的有效生物载体[40,45]。为了验证MAs介导HA/DOX@PPy NGs向肿 瘤位置进行药物递送的抗肿瘤治疗效果,我们在裸鼠体内建立了 4T1 皮下瘤模 型,以进行PTT/化疗联合治疗研究(图2-14A)。治疗组分为以下5组:PBS, free DOX, MAs-NGs, HA/DOX@PPy NGs + L 和 MAs-NGs + L 组,其中,free DOX 组、 HA/DOX@PPy NGs 和 MAs-NGs 组的 DOX 注射量保持一致( mDOX = 42.9昭/只裸鼠),以便进行合理比较。如图2-14B中相对肿瘤体积(V/V0)结果 所示,与其他组相比,经HA/DOX@PPy + L或MAs-NGs + L治疗两周后引起了 最显著的肿瘤抑制(p < 0.001),而且MAs-NGs + L组的肿瘤生长抑制率明显高
56
于HA/DOX@PPy NGs + L组(p < 0.05),证明MAs介导的肿瘤归巢作用和延长 的肿瘤滞留时间有利于抗肿瘤治疗。相反, PBS 组的小鼠肿瘤生长速度最快, free DOX 和 MAs-NGs 组尽管也表现出一定的肿瘤生长抑制作用,但肿瘤进展仍然 比较快。有趣的是,在相同条件下,PTT/化疗联合治疗组(MAs-NGs + L)比单 一的化疗组(MAs-NGs)表现出更显著的治疗效果,这可能是由于近红外激光促 进了药物和 NGs 从 MAs-NGs 的释放,使其更易于被肿瘤细胞吞噬,而且近红外 激光产生的热量也会使肿瘤细胞遭到破坏。此外,微酸性的肿瘤微环境也可以促 进DOX的进一步释放,以提高化疗效果。这种在肿瘤区域触发的快速药物释放 有利于降低药物对正常器官/组织的毒副作用。综上,抗肿瘤治疗效果遵从以下 顺序: MAs-NGs + L > HA/DOX@PPy NGs + L > DOX > MAs-NGs > PBS。
 
 
此外,生存率分析结果显示(图2-14C),在治疗后第40天,MAs-NGs +L 组的小鼠存活率最高(50%),而经 HA/DOX@PPy NGs + L、free DOX、MAs- NGs 和PBS治疗的小鼠均在第34、30、30和第24天全部死亡。这进一步验证 了通过MAs介导的肿瘤递送和PTT/化疗联合治疗使MAs-NGs + L组显示出最 佳的抗肿瘤疗效。同时,我们还记录了治疗过程中各组小鼠的体重变化(图 2-
57
 
14D)。在整个治疗过程中,各组小鼠均未观察到明显的体重变化,这说明各治疗 组均未对小鼠产生明显的毒性作用。
为了进一步确认MAs-NGs + L的治疗效果,我们在治疗结束后第15天获取 肿瘤组织进行了 H&E和TUNEL染色分析。如图2-14E所示,与PBS对照组相 比,在 MAs-NGs + L 组中可以看到大量坏死和凋亡的肿瘤细胞,其次在 HA/DOX@PPy + L、MAs-NGs和free DOX组中也观测到了一定量的坏死和凋亡 细胞。利用 Image-J 软件对 TUNEL 染色图像进行定量分析,得出的肿瘤细胞凋 亡率如图2-14F,显然地,MAs-NGs + L治疗组的细胞凋亡率明显高于其他组(p < 0.01),且其细胞凋亡率与图2-14B中的抗肿瘤治疗结果完全一致。
 
2.3.9 生物安全性评价
首先,在治疗后第 15 天,从各组中随机取一只小鼠进行安乐死,并获取主 要器官进行H&E染色,从组织学水平评估各治疗组是否产生毒副作用(图2-15)。 与PBS对照组比较发现,所有治疗组的心、肝、脾、肺和肾脏的H&E切片均未 观察到明显的组织学异常。需要指出的是,与之前的文献报道[46]相比,本研究中 的DOX组未表现出毒副作用,可能是由于DOX的注射剂量相对较低。此外, 健康裸鼠经尾静脉注射MAs或MAs-NGs后第7天,取其血清,通过分析血清 中的主要生化指标来评估外源性RAW264.7细胞的体内生物安全性,PBS处理的 小鼠作为对照组。其中,选取肝功能指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨 基转移酶(AST)和肾功能参数血尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)来评价小鼠的 肝肾损伤。如图2-16A-D所示,与PBS对照组相比,经MAs或MAs-NGs处理
58
的小鼠未观察到显著的肝肾功能参数变化,这表明 MAs 和 MAs-NGs 没有明显 的肝脏和肾脏毒性。此外,根据文献[47,48]报道,为了进一步评估外源性RAW264.7 细胞是否会诱导不良免疫反应,我们还测量了血清中炎症细胞因子白细胞介素-6 (IL-6)的分泌水平。由图2-16E所示的结果表明,MAs或MAs-NGs的治疗并 未显著影响 IL-6 的分泌,这意味着外源性 RAW264.7 细胞不会在体内引起全身 免疫毒性。同时,我们还发现IL-12、肿瘤坏死因子a(TNF-a)和干扰素y (IFN- Y)等促炎细胞因子发生了轻微上调(图2-16F-H),这可能是由于一部分MAs极 化成为了抑制肿瘤生长的 M1 型巨噬细胞[49]。
2.4本章小结
本章利用了 MAs细胞载体的肿瘤归巢作用介导HA/DOX@PPy NGs向肿瘤 位置特异性递送,用于增强肿瘤的联合光热治疗/化疗。一系列表征结果表明,通 过双乳化法制备的Cys交联的HA NGs可以同时负载光热试剂PPy和抗癌药物 DOX,合成的HA@PPy NGs和HA/DOX@PPy NGs粒径分布均匀,具有良好的 胶体稳定性。体外实验表明,利用HA NGs与MAs表面高表达的CD44受体之 间的特异性识别作用,可以显著增强MAs细胞载体的药物负载量。而且,载药 纳米凝胶的负载并未对MAs-NGs的肿瘤归巢特性和细胞分型产生明显影响,这 可能是由于PPy和化疗药物DOX之间较强的共轭作用避免了 DOX的快速释放, 从而降低了其对细胞载体的毒副作用。体内实验则证明,利用 MAs 介导的肿瘤 归巢作用不但使HA/DOX@PPy NGs更多的聚集到肿瘤部位,并利用该杂化纳米 凝胶良好的光热转换效率(52.7%),在激光照射下促进了 DOX/NGs在肿瘤部位 进行可控的快速释放,从而显著增强 PTT 和化疗的联合治疗效果,有效抑制肿 瘤生长。这种利用 MAs 肿瘤归巢作用介导杂化纳米凝胶的特异性递送有望与不 同的治疗试剂或成像元素相结合,以用于不同的癌症纳米医学应用。虽然 MAs 作为细胞载体表现出了良好的肿瘤归巢特性,但是不可否认地是,活细胞介导的 药物递送仍然还存在一些问题,如不易于储存,载药后需要立即使用;载药量太 低容易耐药,太高则容易对载体产生毒性;易受细胞因子诱导而存在潜在的炎症 风险等,因此,后续我们探索了不同的载药纳米平台,以期改进这些问题。
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64
 
 
第3章 巨噬细胞膜伪装的响应型聚合物纳米凝胶用于磁共
振成像引导的原位脑胶质瘤治疗
3.1 引言
与活细胞载体相比,细胞膜由于没有细胞活性,不会被细胞因子激活,不但 大大降低了发生炎症的风险,而且可以通过细胞膜包覆技术显著提高药物的负载 量。此外,细胞膜可以为纳米颗粒提供伪装,减少网状内皮系统(RES)的吞噬, 还会保留活细胞的一些功能蛋白,使其具有不错的靶向效果,因此本章我们研究 了细胞膜包覆的载药纳米体系在跨越生理屏障、特异性靶向肿瘤并控制药物在肿 瘤位置智能释放中的潜力。
脑胶质瘤是最具侵袭性和致死性的中枢神经系统原发性脑肿瘤,预后差,易 复发,五年生存率不足 5%[1]。目前治疗脑胶质瘤的主要手段是手术、辅助放疗 和化疗[2,3],尽管近年来在脑胶质瘤的治疗方面已经做出了许多努力,但是由于 血脑屏障(Blood-brain barrier, BBB)的存在,使进入颅内肿瘤部位的药物仍然 十分有限,极大的限制了脑胶质瘤的诊断和治疗效果[4]。BBB主要由大脑内皮细 胞、高度特异性的基底膜、包埋在基底膜内的周细胞和星型胶质细胞等组成,相 邻内皮细胞间的紧密连接复合物进一步加强了血脑屏障功能的完整性, BBB 可 以严格控制各种物质的进出,保护中枢神经系统(CNS )免受血液中废物的干扰, 维持 CNS 微环境的稳定[5,6]。这就致使大部分的大分子药物会被 BBB 阻挡难以 进入颅腔内部。虽然 BBB 的紧密连接在脑肿瘤晚期会受到一定程度的破坏,从 而允许一部分药物进入脑部,但是进入肿瘤部位的药物浓度仍不足以达到治疗水 平。早期脑肿瘤的诊断治疗则由于存在较完整的血脑屏障而更具挑战性。因此, 开发新型高效的药物递送体系将治疗剂或造影剂输送至大脑内部进行脑肿瘤的 诊断和治疗显得十分迫切和重要。
纳米材料具有延长的血液循环时间、较高的药物上载率、可控的药物释放能 力、良好的稳定性、生物相容性、表面易于功能化修饰以及优异的被动或主动靶 向能力等优势,这使其在穿越血脑屏障,将负载的诊断或治疗试剂运送到脑部以 进行CNS疾病的诊断治疗方面显示出了巨大的潜力[7-10]。近年来,为了进一步提 高载药纳米材料向脑部的递送效率,开发了许多基于纳米材料的 BBB 穿越策略 [11,12]。一方面,通过机械作用[13,14]、超声波[15-18]或磁性纳米颗粒[19]产生的热量可 以暂时性打开BBBo但是,这种入侵性的BBB破坏方式也允许有害物质进入中 枢神经系统,可能会对中枢神经系统的正常功能造成不可逆的损伤。另一方面, 修饰有细胞穿膜肽或靶向配体的纳米药物可以通过特定配体和相应受体之间的 胞吞作用[20]获得BBB穿透能力[21-23]。然而,BBB穿膜效率取决于细胞穿膜肽的
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选择性和亲和力以及靶向配体与受体的结合能力。此外,基于内源性免疫细胞(如 单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)或干细胞介导的 BBB 穿越策略,可以通过 细胞载体对炎症因子的响应性,将药物有效运输至大脑内部[24,25]。但是上一章中 已经提到,活细胞介导的药物递送具有药物负载率较低的缺陷,负载药物在运输 过程中易于不可控泄漏等,在很大程度上阻碍了细胞介导的药物递送策略的广泛 应用。
为了克服上述纳米材料基 BBB 穿越策略的局限性,细胞膜包覆法作为一种 仿生策略在开发具有较高载药量、增强的脑靶向性以及多种不同类型诊疗试剂的 智能药物递送系统方面具有极大地潜力[12]。例如,包覆了脑胶质瘤细胞膜的仿生 纳米混悬剂可以进一步修饰靶向肽以用于穿越 BBB 并同源靶向脑胶质瘤,进行 原位脑胶质瘤的有效治疗[26]。然而,在这种情况下,需要在癌细胞膜上额外插入 靶向肽才能实现BBB穿越。值得注意的是,巨噬细胞表面高表达的整合素a4、 血等,可以与肿瘤部位的血管内皮粘附分子-1 (VCAM-1)发生相互作用,促进 巨噬细胞向肿瘤或转移瘤的迁移[27,28]。而且,巨噬细胞膜上的整合素a4、卩1或巨 噬细胞-1抗原(Mac-1 )等在穿越BBB特异性靶向脑胶质瘤中也起到至关重要 的作用[6]。因此,利用巨噬细胞膜包覆纳米材料的仿生策略,有望协助负载不同 诊疗试剂的载药纳米材料有效的跨越BBB,进行原位脑胶质瘤的诊断治疗。
纳米凝胶(NGs)作为具有溶胀特性的三维网状结构纳米颗粒(NPs),集合 了水凝胶和NPs的双重优势,包括刺激响应性、优异的流动性和变形性、较高的 载药量、可控的药物释放行为、良好的生物相容性、易于表面功能化修饰等[29,30]。 通过不同方法合成的 NGs 可用于装载不同的治疗试剂和成像剂,从而实现肿瘤 的诊断和治疗[31]。例如,使用聚乙烯亚胺稳定的 NPs 作为交联试剂,通过双乳 化法形成的海藻酸钠纳米凝胶(ALG NGs)或y-聚谷氨酸纳米凝胶(Y-PGA NGs) 可用于装载 Fe3O4 NPs[32,33]、Mn3O4 NPs[34]、或 Au NPs[35],以用于磁共振(MR) 成像或计算机断层扫描(CT)成像。此外,通过双乳化法[36,37]或沉淀聚合法[38]制 备的NGs可以用作纳米反应器原位负载导电聚合物或MnO2 NPs等功能性成分, 以实现肿瘤的联合治疗或诊疗。结合 NGs 和细胞膜仿生策略的突出优势,有望 开发一种基于 NGs 的新型仿生诊疗纳米平台,以将更多的诊疗试剂运输至大脑 实质用于CNS疾病的成像和治疗。
本章以还原响应的聚N-乙烯基己内酰胺纳米凝胶(PVCL NGs)作为载体负 载MnO2和顺铂(Pt),并选用巨噬细胞膜来包覆该载药纳米凝胶,用于穿越BBB 进行原位脑胶质瘤的化疗/化学动力学治疗(图3-1 ),其中产生的效果包括: ( 1 ) BAC交联的PVCL纳米凝胶对肿瘤细胞中较高浓度的GSH( 10 mM)具有还原 响应性,GSH可以使二硫键断裂,纳米凝胶瓦解,从而控制药物在肿瘤位置的释 放。(2) MnO2可以被GSH还原为具有更高弛豫率的Mn2+,Mn2+不仅具有优异
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的MR成像效果,还可以与肿瘤微环境中的双氧水(H2O2)发生类芬顿反应,生 成高毒性的羟基自由基(•OH)o但是肿瘤细胞内高水平的GSH往往会将产生 的•OH清除,降低其对肿瘤的杀伤效果,在此,PVCL NGs和Mn02对GSH的 消耗,可以有效减少GSH对OH的清除,增强化学动力学治疗效果。(3)巨噬 细胞膜对载药纳米凝胶的包覆可以延长血液循环时间,减少网状内皮系统的拦截, 通过膜上的多种靶向蛋白赋予其穿越BBB靶向脑胶质瘤的功能,起到更好的原 位脑胶质瘤治疗效果。
 
 
图3-1.巨噬细胞膜包覆的MM-Pt/MnO2@PVCL NGs (MPM@P NGs)的制备路线示意图
(A), MPM@P NGs跨越血脑屏障进行原位脑胶质瘤的MR成像和联合化疗/化学动力学
治疗研究(B)。
3.2 实验部分
3.2.1 主要实验试剂
表 3-1. 主要实验试剂
试剂名称
N-乙烯基己内酰胺(VCL) 顺铂( Cisplatin) 乙二胺盐酸盐( EDA) 高锰酸钾( KMnO4) 谷胱甘肽( GSH)
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丙烯酸(99%) 上海阿拉丁科技股份有限公司
十二烷基硫酸钠(SDS) Sigma-Aldrich 中国有限公司
亚甲基蓝(MB) Sigma-Aldrich 中国有限公司
2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA, 97%) Sigma-Aldrich 中国有限公司
N',N'-双(丙烯酰)胱胺(BCA) 阿法埃莎(中国)化学有限公司
偶氮二缩乙基-2-异丁基脒水合物(ACMA) 日本和光纯药工业株式会社
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 百灵威科技有限公司
N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 吉尔生化(上海)有限公司
DiR细胞膜染料 迈基生物
4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI) 上海贝博生物科技有限公司
DMEM 培养基 HyClone 实验室有限公司
胎牛血清(FBS) 美国 Gibco 生命技术有限公司
青霉素-链霉素(双抗) 杭州吉诺生物医药技术有限公司
Anti-integrin a4 (19676- 1-AP ) Proteintech 集团有限公司
Anti-integrin 內 (AF1171) 碧云天生物技术有限公司
再生纤维素透析膜(MWCO = 1000) 上海源叶生物科技有限公司
大鼠神经胶质瘤细胞系(C6细胞)、小鼠脑微血管内 中国科学院生物化学与细胞生物
皮细胞系(bEnd.3细胞),小鼠巨噬细胞系 学研究所
(RAW264.7)
超纯水(电阻率>18 MQ cm) 上海乐枫生物科技有限公司
 
3.2.2 材料的合成
3.2.2.1M@P NGs 的合成
根据前期的工作[38],首先通过沉淀聚合法合成PVCL-COOH NGs,经乙二胺 修饰后形成带氨基的PVCL-NH2 NGs,然后利用伯氨基与高锰酸钾(KMnO4)之 间的氧化还原反应在PVCL NG内原位合成MnO2 NPs。简言之,取20 mL PVCL- NH2 NGs (4.56 mg/mL) ,PVCL NGs 与 KMnO4 的质量比设定为 1:0.25,在搅拌 条件下,通过注射泵将4.56 mL KMnO4溶液(5 mg/mL)以0.05 mL/min的注射 速度逐滴滴加到上述PVCL NGs中,混合溶液持续搅拌过夜。第二天用分子量为 1000的透析袋透析3天,以去除残留的KMnO4和杂质,即得到棕色的 MnO2@PVCL NGs (M@P NGs)。取一部分纯化的棕色液体进行冷冻干燥以确定 质量浓度,剩余的溶液储存在4弋中以供进一步使用。
3.2.2.2PM@P NGs 的合成
取上述纯化的M@P NGs,通过物理包覆法负载抗癌药物顺铂Pt,M@P NGs
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与顺铂的质量比设定为1:0.25 (M@P NGs : cisplatin = 1:0.25,质量比)。称取顺 铂13.5 mg溶于6.75 mL水,将顺铂溶液加入到10 mL M@P NGs (5.4 mg/mL) 中,在室温、避光条件下磁力搅拌24 h。然后13000 rpm离心30 min,以除去上 清中未负载的顺铂,收集沉淀回溶于水或 PBS 溶液中,即得到负载了顺铂的纳 米凝胶Pt/MnO2@PVCL NGs (记作PM@P NGs)。取一部分PM@P NGs冷冻干 燥后定重,并用王水消化,然后通过ICP-OES测定并计算得出Pt的载药量(LC%) 和包封率(EE%):载药量(LC%) = [(cisplatin上载量)/ (PM@P NGs的总重 量)X100%,包封率(EE%) = (cisplatin 上载量)/(cisplatin 投料量)]x 100%。 其余溶液置于4 °C冰箱备用。
3.2.2.3巨噬细胞膜的提取和MPM@P NGs的制备
取呈对数生长期的小鼠巨噬细胞(RAW264.7) 5X107个,在1000 rpm转速 下离心5 min得到细胞沉淀,向细胞沉淀中加入3 mL低渗细胞裂解液(含体积 分数为10%的PMSF),在冰下孵育15~30 min,然后采用冻融法,于液氮中快速 冷冻、再在37 C快速融化,反复冻融3次。随后,将其先在4 C, 850 g离心力 下离心15 min以去掉细胞器沉淀,取上清液在18000 g, 4 C再次离心60 min, 保留沉淀,将其重悬于 PBS 或水溶液中即得到巨噬细胞膜悬液。
取上述提取的巨噬细胞膜用来包裹载药纳米凝胶PM@P NGs,简单地说, 将巨噬细胞膜与PM@P NGs以一定比例混合,利用Avanti微型挤出器将混合溶 液反复挤出,并通过0.8 pm孔径的聚碳酸酯膜,反复挤压至少11次,即获得 MPM@P NGso 此外,利用 a4 和血整合素抗体(anti-integrin a4 和 anti-integrin a4) 处理的 MPM@P NGs (Blocked MPM@P NGs)作为对照组。
3.2.3 材料的表征
3.2.3.1材料表面电势和水动力学直径测试
配制质量浓度为 0.5 mg/mL 的 PVCL-COOH NGs, PVCL-NH2 NGs, MnO2@PVCL NGs (M@P NGs) , Pt/MnO2@PVCL NGs (PM@P NGs)和 MM- Pt/MnO2@PVCL NGs (MPM@P NGs),分别测试其在室温25 C下的水动力学粒 径和表面电势变化,每个样品测量 3 次。
3.2.3.2X射线光电子能谱(XPS)测试
取1 mL的M@P NGs和PM@P NGs溶液进行冷冻干燥,然后用于XPS测 试以分析Mn和Pt元素及其价态。
3.2.3.3•OH的生成能力评价
由于羟基自由基(•OH)会使亚甲基蓝(MB)发生降解而褪色,因此MB被 用作OH的指示剂。为了检测Mn2+或PM@P NGs在不同条件下生成OH的能
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力,将含有 25 mM NaHCO3、10 mM H2O2和不同浓度 GSH(0〜10 mM)的 MnSO4 或 PM@P NGs 溶液([Mn]=0.5 mM,0.99 mL)分别与 MB 溶液(0.01 mL)混 合,并使MB的最终浓度为10昭/mL。然后,将上述混合物溶液(1 mL)震荡 5 s后置于室温下放置30 min,通过UV-vis光谱监测在665 nm处的MB吸光度 变化评估OH诱导的MB降解情况。为了便于进行比较,还测试了在相同条件 下,含有 25 mM NaHCO3 和 10 mM H2O2 的 MB 混合溶液(10 yg/mL,1 mL)在 665 nm 处的吸光度。
3.2.3.4抗非特异性蛋白吸附测试
为了验证巨噬细胞膜的包覆是否可以增加纳米凝胶的抗非特异性蛋白吸附 能力,利用紫外可见光谱评估了 PM@P NGs (包膜前)和MPM@P NGs (包膜 后)对非特异性蛋白的吸附能力变化。称取11 mg的牛血清白蛋白(BSA)溶解 于PBS中,并用BSA溶液与PM@P NGs和MPM@P NGs混合,配制成不同Pt 浓度(2、5、10、20和50 yg/mL)的BSA溶液,使BSA的最终浓度为1 mg/mL。 同样浓度的BSA溶液(1 mg/mL)作为对照。然后,将上述溶液置于恒温水浴锅 中,37。0孵育2 h。再以13000 rpm,离心30分钟,收集上清液。用紫外可见 分光光度计分别测量孵育前后BSA溶液(1 mg/mL)在278 nm处的吸光值,利 用吸收值的差异(AAbsorbance)来评估PM@P NGs和MPM@P NGs的抗蛋白 吸附能力。
3.2.3.5透射电子显微镜(TEM )和元素能谱(Mapping )测试
我们采用TEM观察测试了 PM@P NGs的形貌,并用TEM和元素能谱分析 确认巨噬细胞膜是否包覆在了 PM@P NGs 上。用超纯水将 PM@P NGs 和 MPM@P NGs稀释到浓度约为1 mg/mL,然后分别取5 yL滴在铜网上并用电烤灯 照射5~10 min,至干燥以后用于TEM和mapping测试,其中加速电压为200 kV。
3.2.4顺铂和Mn2+的释放行为研究
为了考察GSH (10 mM)存在(GSH (+))或不存在(GSH (-))条件下和不 同的pH (pH 7.4或pH 5.5)环境中,顺铂和Mn2+从NGs中的释放情况,将2 mg PM@P NGs或MPM@P NGs分别分散在1mL磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.4)或 柠檬酸钠缓冲液(pH 5.5)中,并置于再生纤维素透析袋(MWCO=12000-14000) 内,扎紧透析袋两端后浸入9 mL相应的缓冲介质中,然后在37 °C的恒温摇床 中持续振荡。其中,对于pH 5.5、GSH ( + )组,在NGs溶液和缓冲介质中添加 10 mM GSH。在药物释放过程中,每组在预定的时间间隔各取出1 mL缓冲介质, 随后补充1mL相应的缓冲液,以使外相缓冲介质的体积保持恒定。每个样品设
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置3个平行。通过ICP-OES测定Pt和Mn的浓度,以计算在不同条件下释放出 的顺铂和Mn2+的累积释放量。
3.2.5T1弛豫率性能测试
首先通过ICP-OES测定MPM@P NGs中Mn元素的含量,然后分别配制不 同 Mn 元素浓度([Mn] = 0.125、0.25、0.5、1 和 1.5 mM)的 MPM@P NGs 和 MPM@P NGs + GSH ( 10 mM)溶液各1 mL。用0.5-T NMI20核磁共振成像仪 依次测量不同Mn浓度下样品的T1弛豫时间,将弛豫时间的倒数(1/T1)与对 应Mn浓度进行线性拟合,斜率即为材料的弛豫率(n)。测量参数如下:TR = 400 ms, TE = 20 ms,分辨率=156 mmX 156 mm,截面厚度=0.5 mm。另外,上 述溶液的伪彩色T1加权MR图像在3.0-T MR成像系统(Discovery MR750, GE Healthcare, Milwaukee, WI)上采集,使用SE/2D序列获取,参数如下:TR = 400 ms, TE = 12.2 ms, NEX = 4.00, matrix = 256X256,切片厚度(slice sickness) =2 mm,切片间距 (slice space) = 0.8 mm, FOV=12 cm。
3.2.6细胞实验
3.2.6.1细胞培养
C6细胞(大鼠胶质瘤细胞系)、bEnd.3细胞(小鼠脑微血管内皮细胞系)和 RAW264.7细胞(小鼠巨噬细胞)分别在37°C和5% CO2培养箱中,用添加了 10% FBS和1%双抗(青霉素、链霉素)的高糖培养基(DMEM)进行培养。
3.2.6.2细胞毒性分析
使用细胞增殖与细胞毒性检测试剂盒(CCK-8)评估cisplatin、M@P NGs、 PM@P NGs和MPM@P NGs对bEnd.3细胞和C6细胞的体外细胞毒性。具体地, 将细胞以1X104个/孔的细胞密度接种到96孔板中,在37C、5% CO2条件下培 养过夜。第二天,去掉旧培养基,换成含有不同浓度材料(cisplatin、M@P NGs、 PM@P NGs或MPM@P NGs)的新鲜培养基(100 pL/孔),并控制Pt的终浓度 依次为 0 pg/mL、2 pg/mL、5 pg/mL、10 pg/mL、20 pg/mL 和 50 pg/mL,其中未 负载顺铂的M@P NGs的浓度与负载了顺铂的NGs的浓度保持一致,置于37 oC、 5% CO2的培养箱中培养24 ho然后,再次去掉培养基,并用PBS冲洗3次,加 入含有10% CCK-8的无血清DMEM培养基(100 pL/孔),在常规培养条件下继 续避光孵育2~4小时。最后,通过Multiskan MK3酶标仪记录450 nm处每孔的 吸光度,其中以PBS处理的细胞作为空白对照,细胞活力记为100%o此外,根 据上述步骤,还对Mn2+或M@P NGs在不同Mn浓度下([Mn] = 0~50 pg/mL) 对C6肿瘤细胞的细胞存活率影响进行了研究。对于每个样品,分别设置5个平 行,以计算平均值和标准差。
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3.2.6.3细胞凋亡检测
将C6细胞以5X105个细胞/孔的密度接种于6孔板中,每孔加入2 mL含有 10% FBS和1%双抗的高糖培养基孵育过夜。然后,移除旧培养基,在每孔中加 入含有 Mn2+、顺铂、M@P、PM@P 或 MPM@P NGs ([Pt] = 5 yg/mL, [Mn] = 2.6 yg/mL)的新鲜培养基孵育12 h。之后,收集上层培养基,再加入胰酶消化细胞, 将上层培养基与消化下来的细胞悬液合并后置于1000 rpm的转速下离心、收集 细胞沉淀。将该细胞沉淀用PBS洗涤3次,再用400 yL上样缓冲液(Annexin V binding buffer)重悬细胞,然后在避光条件下加入5 yL Annexin V-FITC在4°C下 孵育10分钟,然后再加入10 yL PI染料继续避光染色10分钟。紧接着,通过流 式细胞仪(Becton Dickinson FACScan)上样,测定上述样本的凋亡情况。Annexin V-FITC/PI的不同标记模式用于鉴定不同的细胞分群,其中左下象限(FITC-/PI-) 的细胞为正常的活细胞,右下象限(FITC+/PI-)的细胞为早期凋亡细胞,右上象 限(FITC+/PI+)的细胞为晚期凋亡细胞,左上象限(FITC-/PI+)的细胞则表示 坏死细胞。使用 FlowJo 软件对所测得的数据进行分析。
3.2.6.4细胞吞噬性能分析
通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)研究MPM@P NGs的细胞摄 取行为,未包膜的PM@P NGs和用整合素抗体(Anti-integrin a4、anti-integrin血) 阻断的 Blocked MPM@P NGs 用作对照。简言之,将 bEnd.3 细胞或 C6 细胞以 5x105个/孔的细胞密度接种到6孔板中,每孔加入2 mL培养基,并在37C和含 有5% CO2的培养箱中培养过夜。第二天,弃掉培养基,加入含有PM@P、MPM@P 或blocked MPM@P NGs ([Pt] = 2 yg/mL)的新鲜培养基并孵育不同时间(0、1、 2、4、6和8 h)。然后去除培养基,用PBS轻轻洗涤3 次,消化、离心、收集细 胞,并进行细胞计数,最后用王水消化,通过 ICP-OES 定量测定细胞内吞噬的 Mn 或 Pt 的含量。
3.2.6.5细胞内活性氧检测
根据文献报道,可渗透性荧光底物2Z,7Z-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA) 可以用来检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的生成[39]。原理是 DCFH-DA可自由穿过细胞膜进入细胞,通过细胞内的酯酶水解为DCFH,然后 没有荧光的DCFH可被细胞内的ROS进一步氧化生成具有绿色荧光的二氯荧光 素(DCF),因此通过监测DCF绿色荧光的强弱可间接反映细胞内ROS的生成 水平。一方面,可以通过激光共聚焦显微镜(CLSM)监测DCF的绿色荧光。简 单地说,将C6细胞以1X105个/皿的密度(2ml培养基/孔)接种到共聚焦培养 皿中,并在培养箱中培养过夜。然后,将细胞与Mn2+、M@P、PM@P或MPM@P NGs([Mn] = 10 yg/mL)共孵育6小时,用PBS清洗3次,再与含有10 yM DCFH-
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DA的新鲜培养基(500 pL)在37C、5% CO2下孵育30分钟。然后,再次用PBS 洗涤细胞3次,加入含有50 pM细胞膜染料DiR的新鲜培养基(500 pL)孵育 15 分钟以进行细胞膜染色。之后,用无血清培养基洗涤细胞 3 次,并用多聚甲 醛固定以后,再用DAPI进行细胞核染色。最后,利用CLSM观察细胞。
此外,我们还利用流式细胞术定量检测了细胞内ROS的产生。将C6细胞以 每孔2X105个细胞的密度接种到12孔培养板中,并培养过夜。之后,移除每孔 中的培养基,并补充1 mL含Mn2+、M@P、PM@P或MPM@P NGs的新鲜培养 基([Mn] = 10 pg/mL),并用添加了 100 pL PBS的完全培养基处理的细胞作为阴 性对照,将其置于37C和5% CO2条件下共培养6 h。然后去掉每孔中的培养基, 并添加含有10 pM DCFH-DA的新鲜培养基(500 pL/孔),与细胞孵育30分钟 后,消化、离心、清洗并收集细胞进行流式细胞术分析。
3.2.6.6细胞内谷胱甘肽水平检测
为了研究NGs对GSH的去除能力,利用GSH/GSSG检测试剂盒测定经不 同处理后C6细胞内的GSH水平[40]。简言之,将C6细胞以2X105个/孔的细胞 密度接种在6孔板中,并培养过夜。然后弃除培养基,用含 Mn2+、 M@P、 PM@P 或MPM@P NGs ([Mn]=10 pg/mL)的新鲜DMEM培养基与细胞持续培养6 h。 然后,将细胞用胰酶消化、离心和收集,并根据 GSH/GSSG 检测试剂盒说明书 进行GSH含量的检测。在此,将PBS处理的C6细胞内的GSH含量定义为100%。
3.2.6.7体外BBB模型的构建和BBB穿透实验分析
根据文献报道[5,6]的方法建立体外BBB模型:将bEnd.3细胞以2.5X 104个/ 孔的密度接种于transwell板(12孔板,康宁)的小室(inserts)中,该小室底部 带有 0.4 pm 孔径的聚碳酸酯膜,然后将小室置于 tranwell 板的下室中,并用含 10% FBS和1%青霉素链霉素的完全培养基,在37 oC, 5% CO2培养箱中培养5-7 天,直至其跨内皮电阻(TEER)达到200~300 Q.cm2,形成类似于BBB紧密连 接的单细胞层(bEnd.3 monolayer),作为体外BBB模型。随后,在12孔transwell 板的下室中接种5X104个/孔的C6细胞,待其贴壁后,再向上室中加入含有不 同材料( PBS, MPM@P, Blocked MPM@P 或 PM@P NGs, [Pt] = 5 pg/mL, [Mn] =2.6 pg/mL)的新鲜培养基,将上室与下室合并培养6 h,然后收集下室中的C6 细胞和培养基,用王水消化后通过ICP-OES测量穿越bEnd.3单细胞层到达下室 的材料含量,以研究NGs穿越BBB能力。
随后利用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒考察了上述各组材料(PBS, MPM@P, Blocked MPM@P 和 PM@P NGs, [Pt] = 5 pg/mL, [Mn] = 2.6 pg/mL )跨越 BBB 到 达下室以后对下室肿瘤细胞的杀伤效果。跨越 BBB 到下室的各组材料与 C6 细 胞继续孵育24 h,然后用4%的多聚甲醛处理下室中的C6细胞30 min,用PBS
73
洗涤3 次,再用含有0.3% Triton X-100的PBS处理5 min。之后,收集细胞并将 其重悬于 TUNEL 检测液中孵育 1 小时,再次用 PBS 洗涤后用于流式细胞术检 测,以分析下室的C6肿瘤细胞凋亡情况。其中经PBS处理的细胞作为阴性对照 组。
此外,为了进一步研究跨越BBB到达下室的各组材料引起C6细胞凋亡的 机理,我们利用蛋白免疫印记实验(Western blot)分析了 Bax、Bcl-2、P53和 PTEN等凋亡相关蛋白的表达情况。穿透BBB到达的下室的各组材料(PBS、 MPM@P、 Blocked MPM@P 和 PM@P NGs, [Pt] = 5 yg/mL, [Mn] = 2.6 yg/mL) 分别与C6细胞孵育24 h后,收集下室肿瘤细胞,用PBS洗涤3次,然后在冰 浴中用含有蛋白酶抑制剂(Phenylmethanesulfonyl fluorid, PMSF)的细胞裂解液 进一步处理30 min以提取蛋白质。将该裂解溶液在12000 rpm转速和4 C下离 心5 min。此后,根据标准方法收集每个样品的上清液进行Western blot分析[41]。
3.2.7 动物模型
所有动物实验均经过东华大学和上海市第一人民医院动物伦理委员会
(IACUC)批准,并遵循国家卫生部的相关政策进行。用于活体磁共振成像和治 疗研究的ICR小白鼠(6-8周龄,30-35 g)购自上海斯莱克实验动物有限公司(中 国上海)。原位脑胶质瘤模型通过如下方法建立:将小鼠麻醉后利用脑立体定位 仪将头部固定,在设定的手术区域备皮、消毒,用刀片轻划开皮肤后在其颅骨上 钻一个小孔,然后经注射孔将5 |iL含有1 X 105个C6细胞的PBS细胞悬液在5 min内,缓慢地接种到每只小鼠的右侧纹状体中(距离前卤背侧2.0 mm,矢状缝 右外侧2.0 mm,深度3.0 mm)。接种5-7天后,用磁共振成像监测并确认是否成 功建立了原位脑胶质瘤模型。建立的原位胶质瘤模型用于后续的体内磁共振成像 和抗肿瘤治疗实验。
3.2.8体内T1 MR成像性能分析
通过体内T1 MR成像确认PM@P NGs或MPM@P NGs跨越BBB靶向原位 脑胶质瘤模型的能力。具体地,将PM@P NGs或MPM@P NGs( [MnOR = 2 mg/kg, 每只小鼠200 yL)经尾静脉注射到小鼠体内,在注射前后不同时间点(分别为0、
1、2、4、8和24 h),通过3.0-T Discovery MR750磁共振成像系统(配备有定制 的啮齿动物接收器线圈)对小鼠的脑部进行磁共振成像扫描。操作参数如下:TE =20 ms, TR = 519 ms, FOV = 100X100 mm,矩阵=336X333。在 MR 成像前, 通过腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉每只小鼠,并使用医用胶带将其固定 在啮齿动物接收器线圈中。
3.2.9 体内抗肿瘤效果分析
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用健康的ICR小白鼠(6-8周龄,30-35 g)作为模式动物构建原位脑胶质瘤 模型以研究 MPM@P NGs 的体内抗肿瘤效果。将成功构建了 C6 原位胶质瘤的 ICR 小白鼠随机分为 6 组,每组 4 只:PBS, M@P NGs, cisplatin, PM@P NGs, MPM@P NGs和Blocked MPM@P NGs。治疗过程中,每3天给药治疗一次,第 一次注射治疗的时间定义为第 0天,分别在第 0、 3、 6天共计治疗3 次。每只小 鼠经尾静脉注射 200 pL PBS、 200 pL 溶于 PBS 的 M@P、 cisplatin、 PM@P、 MPM@P 或 Blocked MPM@P NGs,其中 Blocked MPM@P NGs 组用 anti-integrin a4和anti-integrin血单克隆抗体预先进行阻断处理,每次治疗中,每只实验组小 鼠的注射药物(cisplatin: 3.8 mg/kg)和MnO2 (2 mg/kg)保持一致。同时,利用 磁共振成像系统分别在第 0天、第 3 天、第 6天和第 10天监测和记录肿瘤体积 变化,此时,马根维显(Magnevist, 9.38 mg/只)用作对比剂。此外,隔天测量 一次每只小鼠的体重变化。在治疗 11 天后,每组各随机处死一只小鼠,取出脑 胶质瘤进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining, H&E)染色、TUNEL (TdT- mediated dUTP Nick-End Labeling)染色和Ki67染色分析。肿瘤体积(V)和相 对肿瘤体积分别按下式计算:
V = aXb2/2, (3-1)
其中a代表肿瘤测量长度,b代表肿瘤测量宽度。
相对肿瘤体积 = V/V0 (3-2)
其中,V0和V分别表示给药前/后的肿瘤体积。
3.2.10体内药代动力学和生物分布评价
将 PM@P 或 MPM@P NGs ([cisplatin] = 3.8 mg/kg, 200 pL)通过尾静脉注 射到健康小鼠体内,以研究包覆巨噬细胞膜前后的载药纳米凝胶在体内的药代动 力学行为。然后,分别在预设的时间点(0.5、1、1.5、2、3、4、8和24 h)从小 鼠眼眶动脉采集血样,将采集的血样用王水消化,然后通过 ICP-OES 测量各时 间点时血液中的 Pt 含量。此外,为了考察包膜前后的载药纳米凝胶在体内的生 物分布和代谢情况,还在注射后不同时间点获取了小鼠的心、肝、脾、肺、肾和 脑等主要器官,将各器官称重后用王水消化,然后通过 ICP-OES 检测不同时间 点时各组织器官中Pt的含量,以分析NGs的生物分布和随时间的代谢行为。参 考相关的文献报道,某个时间点血样中 NGs 的百分含量,用该时间点时每克组 织中保留的NGs占初始注射NGs剂量的百分比(%ID/g)来表示[42]。
3.2.11体内生物安全性分析
除此以外,还进一步考察了 MPM@P NGs 的体内生物安全性。首先研究了 治疗结束后小鼠各组织器官的组织形态学变化,在治疗后第 11 天从不同组中随 机取一只小鼠进行安乐死,解剖并获取每只小鼠的心、肝、脾、肺、肾等主要器
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官,用4%的多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片以后进行H&E染色。之后,通过倒 置相差显微镜观察样本的组织形态变化。
然后通过溶血实验和血常规检查进一步评估了 MPM@P NGs的血液相容性。 溶血实验按照文献报道的标准方法和操作步骤进行[41]。简单地说,取1 mL血样 加入3 mL PBS进行稀释,然后通过2~3次反复离心/再分散过程(2000 rpm, 10 min/次)获得红细胞(RBC)沉淀。获取的红细胞用4 mL PBS稀释后备用。为 了测试溶血效应,分别取0.1 mL上述稀释的红细胞悬液加入到0.9 mL水(阳性 对照)、PBS(阴性对照)和含有不同浓度MPM@P NGs( 1、2、5、10和20 pg/mL) 的PBS溶液中,然后置于37°C下孵育2 ho之后,将该混合液在13000 rpm转速 下离心20 min,对离心后的样品进行拍照,并通过紫外-可见分光光度计测量541 nm处上清液中的吸光度。同时,不含红细胞的相同浓度的MPM@P NGs也按上 述过程处理后进行 UV-vis 检测,并用来扣除背景吸收。最后,根据以下公式计 算每个样品的溶血率:
溶血率(%) =[(样品吸光度- 阴性对照吸光度) /(阳性对照吸光度- 阴性 对照吸光度)]X100%。 (3-3)
对于血常规检查,将PM@P或MPM@P NGs经尾静脉注射到健康小鼠体内 ([MnO2] = 2 mg/kg, [cisplatin] = 3.8 mg/kg,分散于 200 yL PBS 中),并将 PBS 处理的小鼠作为对照组。在注射后14天,用戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉小鼠 (n=3)后,通过移除小鼠眼球获取血样,然后通过迈瑞BC-2800vet血液分析仪 进行血常规分析。
3.2.12 统计学分析
实验数据以平均值土标准偏差(Mean 土 SD) (n23)表示。采用单因素方 差分析方法,通过IBM SPSS统计软件(IBM, Armonk, NY)评估各组间实验 数据的显著性水平。选择0.05作为显著性水平,所有数据分别标记为(*)表示 p < 0.05, (**)表示 p < 0.01, (***)表示 p < 0.001 o
3.3结果与讨论
3.3.1MPM@P NGs的合成与表征
在本章工作中,我们首先利用沉淀聚合法制备了二硫键(S-S)交联的PVCL- COOH NGs,用过量乙二胺氨基化以后得到PVCL-NH2 NGs,然后利用氨基和 KMnO4之间的氧化还原反应在PVCL-NH2 NGs中原位负载MnO2 NPs,以制备 得到MnO2@PVCL NGs (简称M@P NGs) [38]。接下来,通过物理包覆法将化疗 药物顺铂(Cisplatin)负载在M@P NGs中,得到Pt/MnO2@PVCL NGs (简称
76
PM@P NGs)o最后,利用Avanti细胞膜挤出器,通过反复挤出法将巨噬细胞膜 包覆到PM@P NGs表面,形成细胞膜包覆的载药纳米凝胶(MM-Pt/MnO2@PVCL NGs,简称MPM@P NGs) [43]。首先,通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICP- OES)分别测量了 PM@P NGs 和 MPM@P NGs 中 MnO2 的负载量、cisplatin 的 载药量(LC%)和包封率(EE%)o如表3-2所示,在包膜前的PM@P NGs 中, MnO2的负载量、cisplatin的载药量(LC%)和包封率(EE%)分别为5.4%、8.7% 和53.2%。而在包膜以后的MPM@P NGs中,MnO2的负载量和cisplatin的载药 量(LC%)分别下降到了 2.6%和4.9%,这应该是由于巨噬细胞膜的包覆所致。
表3-2. PM@P NGs和MPM@P NGs中MnO?的上载量、cisplatin的载药量(LC%)与包封
率( EE%)
Samples MnO2 loading percentage LC% EE%
PM@P NGs 5.4% 8.7% 53.2%
MPM@P NGs 2.6% 4.9% 53.2%
 
利用动态光散射(DLS)和Zeta电位分析所制备的PVCL-COOH NGs, PVCL- NH2 NGs, M@P NGs, PM@P NGs和MPM@P NGs的水动力学粒径和Zeta电位 变化。如图3-2A-B所示,制备的PVCL NGs经过量乙二胺胺基化后,其水动力 学直径从295.9 土 15.3 nm略微减小到278.9 土 3.9 nm,并且表面电势从-13.7 土 0.2 mV变为17.5 土 0.8 mV,证明带负电荷的羧基(-COOH)成功转变为了带正电荷 的氨基(-NH2)。在进一步负载了 MnO2和Pt以后,PM@P NGs的水动力学粒径 出现了增加,变为301.5 土 3.1 nm,电势则变为-10.2 土 0.4 mV,说明MnO2和Pt 已成功负载到了 NGs上。利用Avanti微型挤出器包覆了巨噬细胞膜以后,得到 的MPM@P NGs水动力学粒径明显减小为270 土 3.7 nm,表面电势为-8.2 土 0.2 mV,水动力粒径的减小可能是由于包膜后NGs的团聚减少所致。
然后,利用X射线光电子能谱(XPS)进一步验证MnO2和cisplatin在M@P NGs或PM@P NGs中的负载。从XPS全谱(图3-2C)和Mn2p扫描(图3-2D) 可以看到,在642.4和654.2 eV处出现的两个峰可归属于MnO2的Mn 2p“2和 Mn 2pe自旋轨道峰,表明在PVCL NGs中成功形成了 MnO2 NPs。此外,图3- 2C和3-2E中出现在72.9 eV和75.9 eV的另外两个峰则归属于cisplatin的Pt 4f5/2 和 Pt 4f7/2 自旋轨道峰。这些结果表明已成功制备了负载 MnO2 和 cisplatin 的 PM@P NGs。
77
 
 
图 3-2.制备的 1. PVCL-COOH, 2. PVCL-NH2, 3. M@P, 4. PM@P 和 5. MPM@P NGs 的水动 力学直径(A)和zeta电势(B)变化。M@P NGs和PM@P NGs的X射线光电子能谱 (XPS)分析(C),以及 M@P NGs 的 Mn2p扫描(D)和 PM@P NGs 的 Pt4f扫描(E)。 通过UV-vis吸收光谱监测Mn2+介导的类芬顿反应引起MB降解的情况和对应的MB溶
液照片(F);在不同GSH浓度下(0.5-10 mM), PM@P NGs通过类芬顿反应引起的
MB降解及对应的MB溶液照片(G)。当[GSH] = 10 mM时,经Mn2+或PM@P NGs处 理的MB溶液的降解率(H)。其中在F-H的缓冲液中,[NaHCO3] = 25 mM, [Mn] = 0.5 mM, [H2O2] = 10 mMo在不同Pt浓度下,与PM@P NGs或MPM@P NGs孵育前后的 BSA (1 mg/mL) 的 UV-vis 吸收值差异(Aabsorbance) (I)。**p < 0.01, ***p < 0.001
( n=3 )。
据报道,MnO2可以与GSH发生氧化还原反应,从而降低肿瘤微环境(Tumor microenviroment, TME)中的GSH含量,同时形成Mn2+离子,通过Mn2+介导的 类芬顿(Fenton-like)反应产生大量的细胞毒性羟基自由基(9H) [44],杀伤肿 瘤细胞。一般而言,癌细胞和肿瘤微环境中存在高水平的GSH,过量的GSH会 消耗化学动力学治疗(CDT)产生的OH,从而降低CDT的治疗效果。因此,下 调细胞内GSH的水平是提高CDT疗效的重要途径。在此,我们以MB作为OH 指示剂,研究了单纯的Mn2+或PM@P NGs通过类芬顿反应诱导毒性OH的产生 情况(图3-2F-H)o从图3-2F中可以看出,在HCO3-(25 mM)的存在下,当MB 与MnSO4 ([Mn] = 0.5 mM)和H2O2 (10 mM)的混合液共孵育30 min后,在
78
 
665 nm 处观察到 MB 的特征吸收峰显著降低, MB 溶液也从蓝色变为无色,这 是由于棕色的MnO2与GSH发生反应,逐渐被还原为无色的Mn2+,生成的Mn2+ 进而与H2O2反应产生OH,从而使MB发生降解褪色。这表明在生理微环境 (NaHCOs/CO2缓冲液)中, Mn2+可以与H2O2发生类芬顿反应有效地生成9H。
而当MB与MnSO4 (0.5 mM)、H2O2 (10 mM)和10 mM 的GSH混合液共孵育 30 min后,MB的特征吸收峰只出现了微弱的下降,溶液颜色变化也不明显,这 说明过量GSH的存在会清除产生的OH,从而限制CDT的疗效。如图3-2G,同 样地,在HCO3- (25 mM)的存在下,将MB与一定浓度的PM@P NGs ([Mn]= 0.5 mM)和H2O2 (10 mM)混合,同时加入不同浓度的GSH (0.5、1、2、5、 10 mM),从图中看到MB的降解首先随着GSH浓度的增加(0.5-2 mM)而增 加,而当GSH浓度继续增加至5-10 mM时MB的降解能力出现了下降,这可能 是由于过量的GSH消耗了生成的OH。值得注意的是,如图3-2H,经计算可知, 在相同的GSH浓度(10 mM)下,PM@P NGs的MB降解率(68.7%)约为Mn2+
(20.3%)的3.38倍,这说明MnO2通过与GSH反应有效下调了体系中GSH的 含量,从而可以减少过量的GSH对毒性OH的消耗,有望产生更好的化学动力 学治疗效果。
 
图3-3.包膜前PM@P NGs的TEM图片(A-B)及其粒径分布柱状图(C),经细胞膜挤出
器挤出的空巨噬细胞膜囊泡(D)、及以不同投料比条件下包覆的MPM@P NGs的TEM图
片:membrane/NGs = 0.4 :1 (E)或 1:1 (F),细胞膜包覆厚度约为 25 nm。MPM@P NGs
的高角环形暗场像(HAADF)及TEM元素能谱图(G), scale bar = 50 nm。
79
我们通过抗蛋白吸附实验评价了包覆巨噬细胞膜前后 NGs 的抗非特异性蛋 白吸附能力。将PM@P NGs和MPM@P NGs分别与牛血清白蛋白(BSA)混合, 配成 BSA 浓度为 1mg/mL、含有一系列浓度 NGs ([Pt] = 2、5、10、20、50 yg/mL) 的混合液,将其置于37C下孵育2 h。随后,利用UV-vis记录孵育前后的BSA 溶液在278 nm处的紫外吸收值变化(Aabsorbance)。从图3-2I看到,随着浓度 增加,包膜以后MPM@P NGs的Aabsorbance吸收值变化均明显低于未包膜的 PM@P NGs的NGs (p < 0.01),说明巨噬细胞膜的包覆赋予了 NGs优异的抗非 特异性蛋白吸附能力。
为了确认巨噬细胞膜是否成功包覆到了 NGs 表面,我们利用透射电子显微 镜(TEM)成像来观察包膜前后PM@P NGs和MPM@P NGs的粒径大小及形貌 (图3-3 )o如图3-3A-C的TEM图像所示,PM@P NGs具有均匀的球形形貌和 良好的单分散性,平均粒径为106.3 土 &4 nm。其TEM尺寸显著小于DLS测量 的水动力学尺寸(301.5 土 3.1 nm),这应该是由于TEM测量的是干燥状态下收 缩的 NGs 的大小,而 DLS 测量的是在水溶液中吸收了很多水分的膨胀状态的 NGs[36]。与图3-3D中的空细胞膜囊泡相比,我们看到MPM@PNGs表面成功包 覆了厚度约为25 nm的巨噬细胞膜(图3-3E-F)。值得注意地是,当细胞膜的投 料比较低(如membrane/NGs = 0.4:1,质量比,图3-3E)时,NGs只能部分被膜 覆盖,通过增加细胞膜的投料质量比(membrane/NGs = 1:1,图3-3F)可以实现 细胞膜的完全包覆。此外,MPM@P NGs上的细胞膜包覆还可以通过X射线元 素能谱分析(图3-3G)进行进一步验证,我们清楚地看到,除了 Mn和Pt元素, 作为细胞膜磷脂双分子层中存在的代表性元素,P元素也在NGs内均匀分布,说 明了 MnO2和cisplatin在MPM@P NGs内的成功负载以及巨噬细胞膜的成功包 覆。
 
图 3-4. PM@P,巨噬细胞膜(Macrophage CMs)和 MPM@P NGs 的 SDS-PAGE 分析结果 (A);整合素 a4和 P1 在 Macrophages, Macrophage CMs 和 MPM@P NGs 上的蛋白表达情 况( B)。
 
80
 
我们通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进一步确认了 MPM@P NGs 上的细胞膜包覆情况。测试前先用 BCA 蛋白定量试剂盒定量分析
Macrophage CMs 和 MPM@P NGs 的蛋白含量,以使二者的蛋白含量保持一致。 如图3-4A所示,在未包膜的PM@P NGs组没有观察到相关的蛋白条带,而包膜 后的MPM@P NGs表现出与巨噬细胞膜组(Macrophage CMs)一致的蛋白条带, 证实了 MPM@P NGs上成功包覆了巨噬细胞膜[45]。此外,为了验证BBB穿越和 脑胶质瘤靶向的潜在机制,我们首先通过蛋白印记实验(Western blotting, WB) 考察了整合素a4和血在Macrophages, Macrophage CMs和MPM@P NGs上的表 达情况[27]。从图3-4B中可以清楚地看到,在Macrophages, Macrophage CMs和
MPM@PNGs
--»-pH7.4GSH(・) pH7.4GSH(-)
pH5.5GSH(-) pH5.5GSH(-)
pH 5.5 GSH (+) v pH 5.5 GSH (+)
3.3.2Cisplatin和Mn2+的释放行为
通过 ICP-OES 研究了在 GSH (+) /GSH (-)、及不同 pH 环境下,cisplatin 和Mn2+从MPM@P NGs中的累积释放行为,为了验证细胞膜的包覆是否会影响 cisplatin/Mn2+的释放,我们还测量了未包膜的PM@P NGs中的药物释放情况, 以作为对照(图3-5A-B)o显然地,在同样的条件下,MPM@P NGs仅比PM@P NGs显示出了略微缓慢的释放,并未显著影响cisplatin/Mn2+的释放行为,这意味 着细胞膜包覆只带来了一定的屏障作用。在pH = 7.4, GSH (-)条件下,PM@P NGs和MPM@P NGs中的cisplatin在96 h内的累积释放量分别为42.8%和37.9%, Mn2+ 的释放量仅有 13.4%和 7.8%;当 pH = 5.5, GSH (-)时,PM@P NGs 和 MPM@P NGs中cisplatin的累积释放量分别增加到了 58%和56.9%, Mn2+的累积 释放量也明显增加至 79%和 73.2%,这说明细胞内的弱酸性环境将有利于 cisplatin的释放,并可以使部分MnO2转化为Mn2+ ;当pH = 5.5,并添加10 mM
81
GSH条件下,在监测时间内(96 h)从PM@P NGs和MPM@P NGs中释放的Pt (84.1%和78.6%)和Mn2+ (97.7%和94%)均进一步显著增加,这一方面是由 于 GSH 使 NGs 内部的 S-S 键断裂发生解体,另一方面 GSH 也可以使更多的 MnO2还原为Mn2+,从而促进了 cisplatin/Mn2+的释放,这为后续的MR成像和增 强化学动力学治疗奠定了基础。
 
 
Mn concentration (mM)
图3-6.在GSH存在(GSH (+))或不存在(GSH (+))时,不同Mn浓度下MPM@P NGs的T1 MR成像图及T1弛豫时间的倒数(1/T1)与Mn浓度之间的线性拟合关系图。
3.3.3T1弛豫性能分析
与MnO2相比,Mn2+由于具有五个未配对的3d电子可以作为更有效的T1 MR对比剂用于MR成像[38,46]。为了评估GSH激活的MR成像性能,我们比较 了经GSH( 10 mM)处理前后MPM@P NGs的n弛豫率。如图3-6所示,MPM@P NGs在GSH存在下的T1弛豫率(n)为9.69 mM-1s-1,比不存在GSH时的弛豫 率(0.57 mM-1s-1)高16倍。这表明GSH响应的MPM@P NGs可以作为一种潜 在的T1 MR对比剂,实现肿瘤位置的特异性MR成像[44,47]。
3.3.4细胞毒性与细胞凋亡性能分析
为了评价GSH清除效应引起的CDT增强效果,我们采用CCK-8法(图3- 7A)分析了经Mn2+或M@P NGs处理后C6细胞的细胞存活率变化。如图3-7所 示,Mn2+和M@P NGs对C6细胞表现出了剂量依赖性毒性,其细胞活力均随着 Mn浓度的增加而下降。尤其值得注意地是,当[Mn] = 50 yg/mL时,经M@P NGs
82
 
处理的C6细胞,其细胞存活率显著低于用相同Mn浓度的MnSO4处理的细胞 (p < 0.001),这证明M@P NGs可以通过下调细胞内的GSH含量而增强CDT 治疗效果。
 
图 3-7.不同浓度的 Mn2+或 M@P NGs ([Mn] = 0、2、5、10、20 或 50 yg/mL)与 C6 细胞
孵育24 h后的细胞存活率(A);不同Pt浓度的cisplatin、M@P、PM@P或MPM@P NGs
与C6细胞(B)和bEnd.3细胞(C)孵育24 h后的细胞存活率;bEnd.3和C6细胞经
MPM@P NGs处理24 h后的细胞存活率比较(D)。C6细胞与不同材料孵育12 h后的流式 凋亡分析(E)及对应的细胞凋亡率(早凋+晚凋)(F)o
CCK-8法用于考察各材料在不同浓度下(0、2、5、10、20、50 yg/mL)对 大鼠脑胶质瘤细胞(C6,图3-7B)和小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3,图3-7C) 的细胞存活率影响,并计算IC50值。如图3-7B所示,与单独化疗组(cisplatin) 和单独的CDT组(M@P NGs)相比,当[Pt] > 10 yg/mL时,经化疗/CDT联合治 疗组PM@P NGs处理的细胞显示出了显著降低的细胞存活率(p < 0.01),证明 化疗/CDT的联合治疗效果优于单一治疗。更重要地是,包覆了巨噬细胞膜的 MPM@P NGs比未包膜的PM@P NGs表现出了更高的抗肿瘤效果(p < 0.001), 这可能是由于通过巨噬细胞膜上的整合素(Integrin a4, Integrin血)与肿瘤细胞表
83
面的血管细胞粘附分子(Vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1 )之间的作 用提高了肿瘤细胞对NGs的吞噬量所致。此外,经计算MPM@P NGs的半数抑 制浓度(Half maximal inhibitory concentration, IC50)为 1.9 pg/mL,明显低于 PM@P NGs (5.0 pg/mL),与上述CCK-8结果一致。同时,从CCK-8法测定的不同材 料对BBB主要成分bEnd.3细胞(小鼠脑微血管内皮细胞系)的细胞相容性结果 看出,在相同的Pt浓度下,bEnd.3细胞与NGs孵育24 h后的细胞活力均明显高 于C6细胞(图3-7C-D)o另外,cisplatin和不同NGs的安全指数(Safety index) 根据以下公式计算:Safety index = IC50 (bEnd.3) /IC50 (C6)(表 3-3)o 从结果看 出,利用GSH去除效应、联合化疗/CDT治疗和细胞膜包覆等手段,MPM@P NGs 在所有组中显示出最高的安全性和最低的IC50值,这表明MPM@P NGs具有优 异的细胞相容性,为后续的体外/体内治疗奠定了基础。
表3-3. bEnd.3细胞和C6细胞与不同材料孵育24 h后的IC50值以及各材料对应的安全指数 (Safety index)。 Safety index = IC50 (bEnd.3)/IC50 (C6)。
cisplatin M@P NGs PM@P NGs MPM@P NGs
IC50 for bEnd.3 16.5 69.5 21.2 13.1
cells (pg/mL)
IC50 for C6 cells 7.5 22.7 5.0 1.9
(pg/mL)
Safety index 2.2 3.1 4.2 6.9
 
我们还利用 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒进行标记,通过流式细胞 术进一步评估了经 Mn2+、M@P、cisplatin, PM@P NGs 或 MPM@P NGs([Pt] = 5 pg/mL, [Mn] = 2.6 pg/mL)孵育12 h后C6细胞的凋亡情况。根据散点图(图
3-7E)和对应的凋亡百分数柱状图(图3-7F)所示,Mn2+介导的类芬顿反应只能 诱导4.53%的C6细胞发生凋亡,而M@P NGs由于其中负载的MnO2具有GSH 去除效应,诱导的细胞凋亡率出现了明显增加(7.03%)。并且,通过联合化疗和 增强的CDT,PM@P NGs产生的细胞凋亡率(17.31%)显著高于单一治疗组M@P NGs和cisplatin (p < 0.001)。此外,可能由于巨噬细胞膜与C6细胞之间的靶向 作用使癌细胞的吞噬量增加,MPM@P NGs诱导的细胞凋亡率(22.7%)明显高 于未包膜的PM@P NGs (p < 0.01)o该结果与上述CCK-8的测定结果一致。
84
 
6
4
2
0
0 1 2 4 6 8 0 1 2 4 6 8
Incubation time (h) Incubation time (h)
图 3-& 通过 ICP-OES 测量 bEnd.3 (A、B)和 C6 细胞(C、D)经 PM@P NGs、MPM@P NGs或Blocked MPM@P NGs孵育不同时间(0、1、2、4、6或8 h)后的细胞吞噬量。
3.3.5 细胞吞噬性能分析
为了验证巨噬细胞膜的包覆对细胞吞噬性能的影响,利用 ICP-OES 分析了 bEnd.3 和 C6 细胞对 MPM@P NGs 的体外细胞摄取行为,未包膜的 PM@P NGs 和用 anti-integrin a4、anti-integrin 血阻断的 Blocked MPM@P NGs 作为对照。如 图3-8所示,通过Mn和Pt的定量分析结果表明,bEnd.3细胞(图3-8A-B)和 C6 细胞(图 3-8C-D)对 PM@P NGs, MPM@P NGs 和 Blocked MPM@P NGs 的 吞噬量均随着孵育时间的增加而呈增加趋势。而且我们观察到,将 bEnd.3 细胞 和C6细胞分别与NGs孵育1、2、4、6或8 h后,包覆了巨噬细胞膜的MPM@P NGs均比未包膜的PM@P NGs显示出了更高的Mn/Pt摄取量(p < 0.05),这可 能归因于巨噬细胞膜上的整合素受体与细胞粘附分子之间相互作用介导了内吞 作用的增加[6]。同时我们还发现,当用整合素抗体(anti-integrin a4和anti-integrin 卩1)阻断MPM@P NGs膜表面的受体以后,Blocked MPM@P NGs在bEnd.3和 C6细胞内的Mn/Pt吞噬量均明显降低。上述结果表明,胶质瘤细胞和bEnd.3细 胞上的VCAM-1可以与巨噬细胞膜上表达的特定整合素(例如a4和卩1)相互作 用,从而促进MPM@P NGs跨越BBB特异性靶向C6脑胶质瘤细胞[48]。
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3.3.6细胞内活性氧检测及GSH含量测试
使用2', 7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为荧光探针,通过激光共聚 焦扫描显微镜(CLSM,图3-9)和流式细胞术(图3-10A-B)检测经不同材料处 理后细胞内ROS的产生。如图3-9A-B所示,PBS处理的C6细胞中的荧光非常 微弱,而Mn2+处理的C6细胞中显示出比PBS对照组较强的DCF荧光,证实 Mn2+离子通过类芬顿反应可以将细胞内的H2O2转化为高活性的OH。此外值得
注意的是,在M@P NGs处理的C6细胞中观察到了明显增强的DCF荧光,且显 著高于Mn2+处理组(p < 0.01),这可能是由于MnO2诱导的GSH清除效应减少 了过量GSH对OH的消耗所致。特别地,用负载了 cisplatin的PM@P NGs处理 C6细胞,使产生的绿色DCF荧光进一步增强(p < 0.05)o 一种可能的机制是 cisplatin可以激活NOX (一种烟酰胺腺嘌吟二核苷酸磷酸氧化酶家族)使其将电 子传输到O2分子并生成O2•-,随后O2•-可被超氧化物歧化酶(SOD) [49]歧化为 H2O2,产生的H2O2进一步与Mn2+作用从而生成了更多的下游・OH。此外我们发 现,用MPM@P NGs处理的C6细胞表现出了最高的绿色荧光强度(p < 0.01), 可能是由于修饰了巨噬细胞膜以后进一步改善了 NGs的内吞作用(图3-8)o随 后,从图3-10A-B中的流式测试结果看到,经不同材料处理后C6细胞中的ROS 水平遵循以下顺序:MPM@P > PM@P > M@P > Mn2+ > PBS,与上述CLSM检 测结果一致。
 
图3-9.经不同材料处理6 h后,通过CLSM观察到的C6细胞内ROS的产生情况(A), 以及通过Image-J定量分析得到的各组细胞中的DCF荧光强度(B)。细胞核用DAPI (蓝 色)进行染色,细胞膜用D1R (红色)染色。
 
此外,为了揭示各组材料对细胞内GSH的清除能力,通过GSH/GSSG检测 试剂盒测量了不同材料处理后C6细胞内的GSH水平(图3-10C)o众所周知,
86
 
癌细胞中过度表达的GSH可以保护癌细胞免受外部氧化应激(如OH或1O2) 的损伤,因此清除癌细胞内过量的GSH对于增强其对CDT治疗的敏感性至关重 要[40,50]。如图3-10C所示,经不同材料处理6 h, C6细胞中的GSH含量符合以 下顺序: PBS(100%)> Mn2+(80.5%)> M@P NGs(63.6%)> PM@P NGs(59.6%)> MPM@P NGs (42.0%)o由于MnO2介导的GSH清除作用和细胞膜包覆增强的 内吞作用,使MPM@P NGs在所有组中显示出最显著的GSH清除效果。
 
图3-10.经不同材料处理6 h后,通过流式细胞术分析C6细胞内ROS的产生(A)及其对 应的相对荧光强度(B),以及利用GSH/GSSG检测试剂盒测得的C6细胞内的相对GSH 含量。
3.3.7体外BBB穿透能力分析
利用 transwell 系统建立体外 BBB 模型,以考查 MPM@P NGs 是否可以跨 越BBB靶向C6脑胶质瘤细胞。如图3-11A所示,将bEnd.3细胞接种在transwell 上室中,连续培养5-7天直至形成紧密的单细胞层,跨内皮电阻(TEER)达到 200-300 Q・cm2[5,26,51],再在transwell下室中接种C6细胞。然后,分别向上室的 bEnd.3细胞中加入MPM@P、Blocked MPM@P或PM@P NGs,将其与下室合并 孵育6 h。在此需要强调的是,巨噬细胞膜上的特定蛋白,包括整合素a4和卩1, 是促进 NGs 跨越 BBB 和靶向胶质瘤的先决条件[6]。因此,用整合素抗体 anti- integrin a4和 anti-integrin 血阻断的 Blocked MPM@P 和未包膜的 PM@P NGs 作 为对照组也进行了验证。孵育 6 h 后,通过 ICP-OES 定量测定穿透到下室中的 Mn/Pt浓度(图3-11B)o显然,包覆了巨噬细胞膜的MPM@P NGs跨越BBB到 达下室的比例最高(Mn: 37.6 土 0.93%, Pt: 32.6% 土 1.12%),而 Blocked MPM@P NGs和PM@P NGs的渗透百分数则显著降低(p < 0.001)o这表明巨噬细胞膜包 覆策略是提高纳米载体BBB穿越能力的有效措施。
穿透BBB到达下室的MPM@P NGs与下室中的C6细胞继续孵育24 h,为 了进一步验证其对下室肿瘤细胞的治疗效果,我们用 TUNEL 检测试剂盒对 C6 细胞进行染色,并通过流式细胞术分析了肿瘤细胞的凋亡情况。如图3-11C-D所 示,与其他各组相比,经 MPM@P NGs 处理的 C6 细胞显示出最高的荧光强度
87
 
(p < 0.001),表明产生了最咼的细胞凋亡效果,这应该归因于MPM@P NGs具 有最高的BBB穿透百分数。与此相反,用anti-integrin a4和anti-integrin血阻断 的Blocked MPM@P NGs和未包膜的PM@P NGs由于其有限的BBB穿透能力而 显示出下降的细胞凋亡效果。这些结果表明,巨噬细胞膜的修饰不仅能促进NGs
 
图3-11.体外BBB模型示意图(A)。各材料穿越BBB到达下室的渗透百分数(B)。C6
细胞与渗透到下室的不同材料孵育24 h后的流式细胞凋亡情况(C)及其对应的平均荧光
强度(D)。C6细胞与渗透到下室的不同材料孵育24 h后,通过Western blot分析的凋亡相
关蛋白的表达(E)及Bax、Bcl-2、P53和PTEN的定量分析结果(F), Bax/Bcl-2的比值
(G),其中 p-Actin 用作内参。静脉注射 PM@P 或 MPM@P NGs ([MnO?] = 2 mg/kg, 200 yL/只小鼠)前后不同时间点对原位胶质瘤的T1 MR成像图片(H)和对应的信噪比(I)。
在(B)、(D)和(F-I)中,*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 o
88
为了阐明MPM@P NGs跨越BBB诱导下室肿瘤细胞凋亡的分子机制,我们 通过Western blot实验研究了肿瘤细胞内凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、P53和PTEN 的表达水平(图3-11E-G)o跨越BBB到达下室的MPM@P NGs与下室中的C6 细胞继续孵育24 h后,我们观察到抗凋亡蛋白Bcl-2 (B-cell lymphoma-2)出现 了明显下调,抑癌基因 P53 则显著上调, Bax 和 PTEN 的表达仅显示出轻微增 加,这说明凋亡通路的激活。此外值得注意地是, Bax/Bcl-2 比值与肿瘤细胞凋 亡成正相关关系, MPM@P NGs 组的 Bax/Bcl-2 比值明显高于 PBS、 Blocked MPM@P NGs 和 PM@P NGs 组(p < 0.001),证明 MPM@P NGs 在抗肿瘤联合 治疗中具有巨大的潜力[27]。
3.3.8体内原位脑胶质瘤的T1 MR成像性能分析
利用T1 MR成像效果考察包膜前PM@P NGs和包膜后MPM@P NGs在小 鼠原位脑胶质瘤模型中穿透BBB的能力。如图3-11H为静脉注射PM@P NGs或 MPM@P NGs 前后不同时间点的小鼠冠状位脑部 MR 图像。从图中看到,脑胶 质瘤位置处的MR信号强度先随着时间不断增加,在注射后4 h达到最大值,然 后在峰值时间点后逐渐降低。这还可以通过定量分析脑胶质瘤位置处的信噪比 (SNR)来进一步验证,如图3-11I所示,在注射后同一时间点,MPM@P NGs 组的信噪比明显高于PM@P NGs组,证明巨噬细胞膜的包覆可以促进MPM@P NGs跨越BBB用于原位胶质瘤的靶向MR成像。
3.3.9 体内原位脑胶质瘤的联合治疗分析
通过上述体外BBB穿透并靶向癌细胞的治疗实验和体内MR成像实验证实, MPM@P NGs显示出优异的体外/体内BBB穿透能力,受此鼓舞,我们进一步在 小鼠脑胶质瘤模型中验证了 NGs对C6原位脑胶质瘤的体内联合治疗效果(图3- 12)o治疗过程如图3-12A所示,每隔3天治疗一次,总共治疗3次,并用MR 成像监测治疗过程中的肿瘤体积变化。其中,为了便于进行合理的比较,各治疗 组:M@P、cisplatin、PM@P、MPM@P 和 Blocked MPM@P NGs 中的 cisplatin 和MnO2的注射量均保持一致。图3-12B为通过T1 MR成像实时监测的脑胶质 瘤生长情况,测量其肿瘤体积并计算相对肿瘤体积(V/V0)变化(图3-12C),从 图中看到,与PBS对照组相比,各治疗组的肿瘤生长均受到了不同程度的抑制。 M@P NGs治疗组比PBS组显示出更显著的肿瘤生长抑制(p < 0.01),说明MnO2 介导的GSH清除作用有效增强了 CDT治疗效果。此外,联合增强的CDT和化 疗,使PM@P NGs的肿瘤抑制作用明显高于单独的CDT治疗组M@P NGs (p <
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0.01)o更重要地是,由于增强的CDT、化疗/CDT联合治疗和巨噬细胞膜修饰提 高了 BBB穿透和靶向能力等多重因素的影响,MPM@P NGs治疗组呈现出最小 的肿瘤体积,与其他治疗组相比显示出了最有效的治疗效果(p < 0.01)o然而, 用a4和卩1整合素抗体阻断的Blocked MPM@P NGs显示出与cisplatin和M@P NGs相近的胶质瘤抑制作用,显著低于MPM@P NGs治疗组(p < 0.01),这从 反面验证了巨噬细胞膜包覆在增强BBB穿透能力、促进胶质瘤靶向特性以用于 有效的联合治疗中具有重要作用[6,27,28]。
 
图3-12.体内抗肿瘤治疗过程示意图(A)。荷载C6原位脑胶质瘤的小鼠经不同治疗后的
代表性MR图像(B)、对应的相对肿瘤体积(C)、小鼠体重(D)和小鼠存活率(E)。治
90
 
疗结束后不同治疗组肿瘤切片的H&E、TUNEL和Ki67染色([Pt] = 3.8 mg/kg, [MnO?]=
2 mg/kg, 200 心/只小鼠)(F)。在(C)图中,**p < 0.01, ***p < 0.001。
同时,我们还记录了各组小鼠在体内治疗过程中的体重变化(图3-12D)o其 中,在PBS组中观察到了明显的体重减轻,这应该与PBS组小鼠的胶质瘤进展 快速有关。而其他各治疗组由于肿瘤生长受到了不同程度的抑制作用,使得M@P、 cisplatin、PM@P和Blocked MPM@P NGs组中的小鼠体重损失相对少于PBS组。 最重要的是,MPM@P NGs治疗组由于其优异的抗肿瘤治疗效果,没有观察到明 显的体重变化。此外,小鼠生存率结果(3-12E)显示,MPM@P NGs治疗组显 示出最高的小鼠存活率,直到第 28 天仍有 33.3%的小鼠存活,而其他各治疗组 到 22 天时已全部死亡。
 
图3-13.经不同治疗后小鼠肿瘤组织的TUNEL阳性百分数(A)和K167阳性百分数
(B)。
治疗结束后,为了进一步确认不同治疗组的抗肿瘤效果,在第 11 天从每组 中随机取一只小鼠进行安乐死,并获取脑胶质瘤,将其固定、切片后进行H&E、 TUNEL和Ki67染色分析(图3-12F)。显然,在所有治疗组中,MPM@P NGs导 致了最显著的肿瘤细胞坏死、凋亡和增殖抑制作用。这可以通过其在H&E染色 图像中明显的细胞收缩和核固缩、 TUNEL 染色图像中最多的凋亡核破碎以及 Ki67图像中最低的Ki67表达而清楚地观察到。另外,还通过Image-J软件进一 步考察了肿瘤组织的TUNEL-和Ki67阳性百分数,以定量分析肿瘤细胞的凋亡 率(图3-13A)和增殖率(图3-13B)o毫无疑问地,MPM@P NGs在所有组中显 示出了最佳的肿瘤抑制效果,这与上述抗肿瘤治疗结果一致(图 3-12B-E)。
91
 
 
3.3.10 药代动力学和组织分布研究
MPM@P NGs的体内药代动力学和生物分布行为通过ICP-OES进行了研究, 未包膜的PM@P NGs作为对照组也进行了测试。将MPM@P NGs或PM@P NGs 静脉注射到健康小鼠体内,通过检测注射后不同时间点时血液中 Pt 的含量来研 究NGs的药代动力学特性(图3-14A)o从图中看到,两种NGs在血液中的Pt含 量均随着时间的延长而降低,经计算,MPM@P NGs和PM@P NGs的血液半衰 期(Half-life, t1/2)分别为 3.37 h 和 1.52 h。并且在注射后 24 h, MPM@P NGs (12.3% ID/g)比PM@P NGs(6.9% ID/g)显示出了更高的血液蓄积含量°MPM@P NGs 显著延长的半衰期应该归因于巨噬细胞膜的包覆赋予了 NGs 优异的抗污性 能和免疫逃逸能力[52],这将有利于提高 NGs 在肿瘤位置的有效聚积。此外,利 用ICP-OES进一步分析了注射后不同时间点各组织器官(心、肝、脾、肺、肾和 脑)中Pt的含量(图3-14B-C)o从图3-14B看至U,MPM@P NGs在心、肝、脾、
92
 
肺、肾、脑等主要脏器中的代谢过程与PM@P NGs非常接近,二者均在肝脏和 脾脏中观察到了较高的Pt含量。这意味着制备的MPM@P NGs可能通过网状内 皮系统器官(肝脏和脾脏)进行代谢,24小时后主要器官中的Pt含量已经降低 到了相对较低的水平,证明NGs可从小鼠体内有效清除。另外如图3-14C小鼠 脑组织的Pt含量结果所示,在注射后2、3、4、8和24 h, MPM@P NGs在脑组 织中Pt含量显著高于未包膜的PM@P NGs (% ID/g, p < 0.01),证实了巨噬细 胞膜的包覆可以有效增加MPM@P NGs在肿瘤位置的聚积,该结果与上述药代 动力学计算的半衰期结果一致。
 
Concentration (pg/mL)
图3-15.血红细胞(RBCs)与不同浓度的MPM@P NGs孵育2 h后测得的溶血率,嵌入的 图片为RBCs与对应浓度的NGs孵育结束并离心后的溶液照片。水和PBS分别作为阳性和
阴性对照。
3.3.11 体内生物相容性评价
最后,我们探讨了所制备的MPM@P NGs的生物相容性。体外溶血实验结 果如图3-15所示,使用不同浓度的MPM@P NGs与RBCs孵育2 h后测得其溶 血率均小于 5%,表明 MPM@P NGs 具有良好的血液相容性。经 PBS, PM@P NGs或MPM@P NGs处理14天后的血常规检测结果如图3-16A所示,与PBS 组相比,PM@P NGs组的白细胞数(WBC)、中性粒细胞数(Gran#)和淋巴细 胞数量(Lymph#)出现了轻微增加,说明PM@P NGs引起了轻度的炎症反应, 而 MPM@P NGs 对所测试的生化参数并未产生明显影响,也证实了其良好的血 液相容性。另外,血生化检测结果如图3-16B所示,静脉注射PM@P或MPM@P NGs以后第14天,并未对小鼠的肝功能(ALT, AST)和肾功能指标(BUN, CREA)产生明显影响,这说明制备的PM@P和MPM@P NGs对肝脏和肾脏没
93
 
 
有明显毒性。
 
图3-16.健康小鼠经静脉注射PBS, PM@P NGs或MPM@P NGs后第14天的血常规
(A)和血生化(B)检测结果。血常规检测包括白细胞数(WBC)、中性粒细胞数
(Gran#)、淋巴细胞数(Lymph#)、血小板数(PLT)、红细胞数(RBC)、血红蛋白
(HGB)、平均红细胞体积(MCV)和平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC);血生化检测包
括丙氨酸氨基转移酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(AST),尿素氮(BUN)和肌酐
(CREA)o灰色区域表示正常参考范围。
 
图3-17.经PBS, PM@P NGs或MPM@P NGs处理后第14天,健康小鼠脑组织的H&E染
色照片。
除此之外,经PBS, PM@P NGs或MPM@P NGs处理健康小鼠后第14天,
取小鼠的正常脑组织进行H&E染色(图3-17),以评估NGs对正常脑组织的影
响。与PBS组相比,PM@P NGs和MPM@P NGs的H&E染色图像中均未发现
明显的组织学损伤。另外,我们还在治疗结束后的第 11 天获取各治疗组 C6 胶
94
 
质瘤小鼠的主要器官(心、肝、脾、肺和肾)进行H&E染色(图3-18)o与PBS 对照组相比,我们在cisplatin组的肝脏组织中观察到了急性坏死和炎性浸润,而 在PM@P, Blocked MPM@P和MPM@P NGs组的其它所有器官(心、肝、脾、 肺和肾)的染色切片中均未观察到明显的病理异常。因此,综合以上测试结果,
 
 
3.4本章小结
在本章工作中,我们开发了一种巨噬细胞膜包覆的负载MnO2和cisplatin的 多功能响应型PVCL NGs仿生纳米平台(MPM@P NGs)用于跨越BBB进行原 位胶质瘤的靶向 MR 成像和联合治疗。通过沉淀聚合法和乙二胺氨基化制备得
95 到的PVCL-NH2 NGs可以通过与KMnO4之间的氧化还原反应在其内部有效负载 MnO2 NPs,还可以通过物理包覆法有效地负载化疗药物cisplatin,并利用细胞膜 挤出器在其表面进一步包覆巨噬细胞膜,以赋予该仿生纳米平台良好的稳定性、 优异的 BBB 穿透能力以及对脑胶质瘤癌细胞的特异性靶向能力。该体系具有非 常独特的优势:(1)负载的MnO2 NPs通过类芬顿反应可以清除癌细胞内过量的 GSH并形成Mn2+,从而增强癌细胞对CDT治疗的敏感性,并实现更好的T1 MR 成像效果;(2) PVCL NGs中的S-S键不仅也可以降低TME中的GSH以增强 CDT效果,而且还可以控制化疗药物在TME中进行响应性释放;(3) Cisplatin 除了提供化疗作用,还可以通过促进H2O2的形成以及下游OH的生成而进一步 提高CDT作用;(4) 巨噬细胞膜的包覆促进了 MPM@P NGs穿越BBB并靶向 脑胶质瘤,更好地进行原位脑胶质瘤的诊断和联合治疗。本章制备的多功能仿生 纳米平台使体外癌细胞的化疗/CDT联合治疗和全身给药后通过MR成像引导的 体内原位胶质瘤模型的诊疗成为可能。总的来说,MPM@P NGs具有良好生物相 容性,有望成为一种有前途的纳米诊疗药物,用于磁共振成像引导的原位胶质瘤 协同治疗。
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100
第4章 可注射多功能水凝胶在抗肿瘤联合治疗中的应用
4.1 引言
通过以上两章的研究看到,多功能纳米凝胶(NGs)与细胞载体治疗或细胞 膜仿生技术相结合,在经静脉注射的全身给药(Systemic drug delivery)方面表现 出了优异的肿瘤特异性聚积和肿瘤微环境响应的智能药物释放等优势,但是全身 给药难以避免的存在肿瘤递送效率偏低的特点。于是我们进一步考虑如何利用局 部给药(Local drug delivery)策略,将更多的治疗试剂局限在肿瘤部位,并控制 药物在肿瘤组织中实现可持续释放。显然,NGs在局部给药方面不具备明显的优 势,而具有优异生物相容性的天然可注射水凝胶引起了我们的兴趣。于是在本章 研究中,我们提出了一种简便的可注射原位凝胶化策略,并将多种治疗试剂负载 于凝胶网络中,以期实现肿瘤的饥饿治疗、增强化学动力学治疗并辅助调节肿瘤 微环境中肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的复极化。
饥饿疗法是一种潜在的有效抗癌策略,它可以阻断肿瘤细胞生长所必需的营 养素或生长因子的供应[1-3]。根据 Warburg 效应,癌细胞利用葡萄糖进行有氧糖 酵解来为自己提供能量,以实现其异常代谢和增殖[4], 因此,降低肿瘤微环境中 的葡萄糖水平为抑制肿瘤生长提供了一种新的思路[5]。最近,葡萄糖氧化酶
(Glucose oxidase, GOx)作为癌症饥饿治疗的候选物得到了广泛研究,GOx是 一种氧化还原酶,具有高度脱氧能力,它可以催化葡萄糖氧化,转化为葡萄糖酸 和过氧化氢(H2O2) [6],从而切断肿瘤生长和代谢所需要的能量供应,促进肿瘤 细胞凋亡。然而,目前的许多研究大都采用静脉给药的方法来实现GOx向肿瘤 部位的靶向输送[7-11],这致使其靶向效率较低,容易脱靶而运输到身体正常组织 部位,引起全身毒副作用,严重降低了 GOx的适用性[12]。因此,采用局部转运 的方式将GOx特异性限制在肿瘤区域是一种有前景的治疗策略,可以有效提高 治疗效果并减少不良反应的发生 。
另外,化学动力学治疗(Chemodynamic therapy, CDT)是利用 Fenton/Fenton- liken反应破坏癌细胞的一种方法[13,14]。在溶酶体的酸性条件下(pH=5), Fe2+和 Fe3+可以离子催化细胞内的H2O2生成具有高度细胞毒性的羟基自由基CHO), 从而触发肿瘤细胞凋亡。近年来,铁磁性纳米颗粒(Fe3O4 NPs)已被证明具有类 似于过氧化物酶的酶活性[15],并进行了各种研究以探索其在化学动力学治疗中 的应用潜力[16-18]。然而,这些Fe3O4 NPs通常具有稳定的立方反尖晶石结构[19], 因此需要在更为苛刻的分解条件(例如,较低的pH值)下才能释放出Fe2+和Fe3+ 离子。此外,尽管癌细胞内具有过度表达的H2O2(50-200 pM) [20],但其H2O2 浓度仍然相对较低,通过这种低效的Fenton反应难以生成足够的・HO来杀伤癌
101
 
细胞[21]。考虑到GOx介导的葡萄糖消耗可以同时引起葡萄糖酸和H2O2的产生, 不仅提高了肿瘤微环境中的酸度,加速Fe2+/Fe3+离子的释放,还可以增加H2O2 的含量。因此GOx与Fe3O4 NPs的结合有望克服上述障碍,解决Fe2+/Fe3+介导 的 CDT 治疗相关的问题。
此外,相关研究指出,肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)在肿瘤的发生、发展和 转移中起着非常关键的作用,并与不良预后呈负相关关系[22]。TAMs具有高度可 塑性,可以被极化为抑制肿瘤生长的M1型(Ml macrophages)或促进肿瘤生长 的 M2 型(M2 macrophages)[23]。最近的研究表明,Fe3O4 NPs[24,25],以及 Toll 样 受体7/8激动剂(resiquimod, R848)可以改变肿瘤微环境(TME)的功能方向, 使 M2 型巨噬细胞复极化为 M1 表型[26,27]。这种转化可有效降低肿瘤微环境中 TAMs的比例,促进Ml型相关的促炎细胞因子的分泌(如肿瘤坏死因子(TNF- a)、白细胞介素-6 (IL-6)和IL-12),使肿瘤支持型微环境得到缓解并进一步抑 制肿瘤的进展[28,29]。
Injectable sol
Glucose oxidase (GOx)
Hydrogel
图 4-1. 可注射多功能水凝胶用于癌症联合治疗的原理示意图。经瘤内注射后,负载有 GPI
NPs (GOx修饰的PI NPs)和R848的ALG溶液能够通过ALG和间质液中存在的Ca2+之 间的原位凝胶化转化为GPI/R848@ALG水凝胶。在该体系中,1) GOx可以通过催化葡萄 糖转化为葡萄糖酸和H2O2,阻断肿瘤细胞的葡萄糖供应,用于饥饿治疗;2)生成的葡萄 糖酸和H2O2通过加速Fe2+/Fe3+的释放以及提高的H2O2含量而增强化学动力学治疗效果;
3) Fe3O4 NPs和R848可以调节TAMs向抑制肿瘤生长的Ml表型转化。
基于上述研究,本章选用天然的海藻酸钠(ALG)为原材料,利用ALG与
内源性Ca2+发生离子交联而成胶的原理,构建了一种负载饥饿治疗试剂GOx、
102
 
Fenton试剂FesO4和Toll样受体激动剂R848三种多功能组分的可注射原位凝胶 体系(图4-1)。简单地说,首先合成聚丙烯酸稳定的氧化铁纳米颗粒(PI NPs) 作为Fenton试剂供体,然后通过EDC偶联反应将GOx连接到PI NPs上以生成 GOx修饰的PI NPs (GPI NPs)。随后,将合成的GPI NPs和Toll样受体激动剂 R848 与 ALG 溶液混合以形成均匀的可注射溶液,将其瘤内注射到肿瘤部位以 后,通过间质液中存在的内源性Ca2+离子与ALG之间的离子交联作用,从而能 够转化为多功能型GPI/R848@ALG水凝胶[30-32]。这种可注射原位凝胶策略不仅 能将GPI NPs和R848特异性地输送到肿瘤部位,而且还能将治疗性组分GOx限 制在肿瘤区域内,以避免GOx通过血液循环到达正常组织,从而减少不良副作 用的发生。此外,利用R848和Fe3O4对TAMs的协同复极化作用,可以将更多 的 TAMs 进行重新极化,以辅助增强抗肿瘤效果。因此,本章制备的多功能型 GPI/R848@ALG 水凝胶有望阻断肿瘤细胞的葡萄糖供应进行饥饿治疗,提高
Fenton反应效率以增强化疗动力学治疗效果,并可以将TAMs调节为M1表型, 从而缓解肿瘤支持型微环境,进一步抑制肿瘤的生长。
4.2 实验部分
4.2.1 实验试剂
表4-1.主要实验试剂
试剂名称 来源
海藻酸钠(AG, Mw = 12-58 kDa 比利时Acros公司
聚丙烯酸(PAA, Mw = 1800) Sigma-Aldrich 中国有限公司
葡萄糖氧化酶(GOx) 上海麦克林生化科技有限公司
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) 百灵威科技有限公司
雷西莫特(Resiquimod, R848) 美国 Glpbio 生物科技有限公司
氯化钙(CaCb) 国药集团化学试剂有限公司
六水合三氯化铁(FeCb6H2O) 国药集团化学试剂有限公司
七水合硫酸亚铁(FeSO4-7H2O) 国药集团化学试剂有限公司
氨水(25~28%) 国药集团化学试剂有限公司
3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB) Sigma-Aldrich 中国有限公司
再生纤维素透析膜(MWCO = 1000) 上海源叶生物科技有限公司
Cy5-NHS Sigma-Aldrich 中国有限公司
小鼠乳腺癌细胞系( 4T1 细胞) 中国科学院生物化学与细胞生物
学研究所
DMEM 培养基 杭州吉诺生物医药技术有限公司
Pierce™ BCA蛋白定量试剂盒 ThermoFisher 科技有限公司
103
PierceTM 定量过氧化物检测试剂盒(水性) ThermoFisher 科技有限公司
超纯水(电阻率>18 MQ cm) 上海乐枫生物科技有限公司
4.2.2 材料的合成
4.2.2.1GPI NPs 的合成
根据文献报道,首先通过共沉淀法合成聚丙烯酸稳定的氧化铁纳米颗粒(PI NPs) [33]。具体地说,取20 mL聚丙烯酸溶液(4 mg/mL)用氩气吹扫1 h以去 除氧气,然后将其加热至100 °C回流。之后,将0.4 mL铁前体溶液(500 mM FeCb6H2O和250 mM FeSO4,7H2。)快速加入到上述聚丙烯酸溶液中,并添加 6.72 mL氨水溶液(25% w/w)。该反应在100 C磁力搅拌条件下回流1 h。反应 1 h后,待溶液冷却至室温,将其转移到透析袋(MWCO = 3.5 kDa)内,在4 C 下用去离子水透析3天。最后使用Amicon Ultra-15型超滤离心管(MWCO=5O kDa)对溶液进行浓缩,再使用离心过滤器(0.1 |im孔径)进行过滤以去除大颗 粒。最后取一部分PI溶液进行冷冻干燥以确定PI NPs的质量浓度,剩余溶液保 持在4C备用。
然后,利用EDC活化聚丙烯酸上的羧基,使其与GOx上的胺基之间发生偶 联反应以得到GOx修饰的PI NPs (GPI NP) [34]。将10 mg PI NPs分散在10 mL PBS (1X )缓冲液中。然后,向上述PI溶液中加入4.4 mg GOx和5 mg EDC, 并在室温下磁力搅拌持续反应4 h。将上述混合物用超纯水透析(MWCO = 1000 kDa) 3天,以得到GPI NPs的最终产物。取一小部分GPI NPs冻干以确定其质 量浓度并进行表征。
合成Cy5标记的GPI NPs (Cy5-GPI NPs)用于荧光实验。具体地说,将20 mg GOx (在 10 mL PBS 中)与 0.77 mg Cy5 NHS 酉旨(在 1 mL DMSO 中)混合, 在室温下搅拌反应4 h。然后用Amicon Ultra-15离心管(MWCO=50 kDa)对混 合物进行5次纯化,得到Cy5-GOx。之后按照上述相同的实验步骤,使用Cy5- GOx制备得到荧光标记的Cy5-GPI NPs。
4.2.2.2可注射水凝胶的合成
称取10 mg海藻酸钠粉末溶于1 mL PBS溶液(0.1xPBS)中配成10 mg/mL 的ALG溶液,加入预先制备好的PI NPs (0.44 mg),或GOx (60昭),或GPI NPs (0.5 mg) 或/和 R848 (0.7 mg),混合均匀后待用:在体外实验中需要额外 加入Ca2+溶液,使Ca2+终浓度为1.8 mM,利用Ca2+与ALG羧基之间的络合作 用转化形成水凝胶;而对于体内成像或治疗实验,将上述混合均匀的溶液直接注 射入体内,利用肿瘤部位或体内的内源性Ca2+与ALG之间的相互作用形成不同 组分的 ALG 水凝胶( PI@ALG, GOx@ALG, GPI@ALG, R848@ALG 和
104
GPI/R848@ALG)。
4.2.3 材料的表征
4.2.2.1 水动力学直径和表面电势测试
分别取制备的PI NPs和GPI NPs,用超纯水稀释到0.5 mg/mL用于水动力 学粒径和表面电势。
4.2.3.2透射电子显微镜(TEM)测试
利用TEM测试PI NPs和GPI NPs的形貌。配制1 mg/mL的PI NPs和GPI NPs溶液,各取5 L滴加到铜网表面,在空气氛围下自然晾干,然后进行TEM 测试。
4.2.3.3扫描电子显微镜(SEM)测试
将用不同浓度的ALG ([ALG] = 5、10和20 mg/mL)制备的ALG水凝胶和 GPI@ALG水凝胶冻干,并在样品表面喷射一层金膜,然后用于进行SEM测试, 测试电压为5 kV。
4.2.3.4傅里叶变换红外光谱(FTIR)测试
分别取少量的GOx、PI NPs和GPI NPs,加入一定量的溴化钾(KBr)粉末 进行充分研磨,然后用油压机进行压片处理,设置扫描波数为500-2000 cm-1.
4.2.3.5流变性能测试
制备的 ALG 水凝胶和 GPI@ALG 水凝胶([GPI] =0.5 mg/mL, [Ca2+] = 1.8 mM)的流变学性能通过流变仪进行检测。在固定应力作用下,测试了不同ALG 浓度的([ALG] = 5、10和20 mg/mL)水凝胶,其储存模量(G)和损耗模量(G") 随角频率的变化情况。
4.2.3.6Fe和GOx浓度的定量分析
通过邻菲罗啉测定法确定PI和GPI NPs中的铁浓度[35]。简单地说,将10 pL PI或GPI NPs样品分散于20 pL盐酸溶液(6M)中,并在60 °C下消化1 h,然 后添加170 pL盐酸羟胺(8.06 M)以将Fe3+还原为Fe2+。1 h后,用0.2 M的 MES缓冲液(pH 7.0)将溶液稀释至1 mL。然后,取400 pL稀释液与300 pL 1,10-菲罗啉一水合物(13 mM)和200 pL醋酸钠(1.22 M)混合。使用V-750紫 外可见分光光度计在 508 nm 处测量样品的吸光度。使用浓度为 0、 20、 40、 60 和80 pM的(Tris) -1,10-邻菲罗啉铁(II)硫酸盐溶液(0.025 M)制备校准曲 线。参考Thermo Scientific的标准操作说明书,使用Pierce™ BCA蛋白分析试剂 盒测定GPI NPs中的GOx浓度。
105
4.2.4 GOx 酶活性评价
首先,通过检测经GOx或GPI NPs处理的葡萄糖溶液(2 mg/mL)的pH值 变化来评估GOx的酶活性。简单地说,将0.5 mL GOx或GPI溶液([GOx] = 0.18 mg)加入到1mL葡萄糖溶液中(2 mg/mL,pH值预先调整为7.4)。使用pH计 监测溶液的pH值随时间的变化。
然后,利用Pierce™过氧化氢定量分析试剂盒(水相)23280检测GOx、GPI 和GPI@ALG产生H2O2的能力。首先用超纯水将H2O2溶液(35 wt%,11.63 M) 分别稀释成0、10、25、50、75和100 |iM的浓度梯度。然后,取10 pL稀释的 H2O2与100 pL试剂盒检测液混合并置于96孔板中。在室温下培养20 min后, 用酶标仪记录595 nm处的吸光度,以建立标准曲线。接下来,将GOx、GPI和 GPI@ALG([GOx] = 0.05 mg/mL)加入到葡萄糖溶液(2 mg/mL,溶于 2.5 mL PBS)中并在37°C下孵育一定时间。在预定的时间点,用移液管取出10 pL上述 溶液,并加入到1 mL超纯水中进行稀释。之后,取10 pL该稀释溶液与100 pL 分析试剂盒检测液混合并置于96孔板中,在室温下再培养20 min后,用酶标仪 记录595 nm处的吸光度。参照绘制的标准曲线计算H2O2浓度。
4.2.5体外OH的产生
利用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为指示剂,研究,HO的产生能力。在 PBS缓冲液(pH 7.4)或MES缓冲液(pH 5)中制备100 yg/mL的GPI溶液。 然后在室温下,取200 mL制备的含有TMB (1 mg/mL)的GPI溶液,在存在/不 存在H2O2(100 mM)和葡萄糖(5 mM)条件下,用酶标仪监测其在652 nm处 的吸光度随时间的变化。最后收集上述反应混合物并拍照。
4.2.6细胞毒性与细胞吞噬性能检测
小鼠乳腺癌细胞(4T1 )来自中国科学院细胞库,用含有10% FBS和1%双 抗的高糖培养基(DMEM),在37 °C和5% CO2的培养箱中进行培养。
首先采用CCK-8测定法评估GOx、PI和GPI对4T1细胞的细胞毒性。简单 地说,将4T1细胞以5000个/孔的密度接种到96孔板中,并加入配制好的DMEM (100 yL/孔)培养过夜。第二天,移除培养基并添加含有PI (0、&8、17.6、44、 66、88 和 132 ng/mL)、GOx (0、1.2、2.4、6、9、12 和 18 ng/mL)或 GPI (0、 10、20、50、75、100和150 ng/mL)的新鲜培养基。在培养箱中孵育24 h后, 小心移除培养基,每孔加入100 yL含10% CCK-8的无血清培养基继续孵育2 h。 最后用酶标仪记录每孔在450 nm处的吸光度。每个样品浓度设置5个平行。
另外,为了通过荧光染色法直观的观测细胞毒性,将4T1细胞接种于12孔 板中并孵育过夜,第二天更换含有PI、GOx和GPI NPs ([GOx] = 12 ng/mL) d
106
的新鲜培养基,于培养箱中孵育2 h。然后,去除培养基并用PBS清洗细胞2次, 加入钙黄绿素(Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)分别对活细胞(绿色)和死细胞 (红色)进行染色,用荧光显微镜拍摄观察死活染荧光情况。
为了考察free GOx和GPI NPs在4T1细胞中的细胞吞噬特性,将4T1细胞 以2X104个/孔的细胞密度接种到Ibidi卩8孔载玻片中并培养过夜。然后移除培 养基,加入含有Cy5标记的GOx或GPI NPs ([GOx] =12 ng/mL)的新鲜培养基, 与细胞孵育2 h,用PBS洗涤细胞3次,并用2.5%戊二醛固定,再用DAPI对细 胞核进行染色,最后通过激光共聚焦显微镜(CLSM)观察细胞内的荧光强度。
4.2.7细胞内OH的检测
取对数生长期的4T1细胞,以2x105个/孔的细胞密度接种于6孔板中,培 养过夜后,更换含有PI NPs、GOx或GPI NPs的新鲜培养基([GOx] = 12 ng/mL), 继续孵育6 h。之后,去掉培养基,用PBS清洗2次,加入荧光探针DCFH-DA (20 yM),置于培养箱中避光孵育20 min以检测细胞内产生的但0。然后,使 用荧光显微镜(GFP通道)观察各组产生的DCF绿色荧光情况。
4.2.8体外TAMs复极化性能评价
将肿瘤相关巨噬细胞TAMs与不同配方的水凝胶孵育24 h后,利用transwell 装置检测TAMs的复极化行为。据报道,TAMs具有类似于M2型巨噬细胞的特 性[36]。于是,首先将原代巨噬细胞以1x105个细胞/孔的密度接种到12孔transwell 板的下室中,培养过夜,然后加入含有IL-4(40 ng/mL)的新鲜培养基处理24 h, 使其转化为M2型巨噬细胞。接下来,分别取50 yL的ALG、PI@ALG、GOx@ALG、 GPI@ALG、R848@ALG 和 GPI/R848@ALG 水凝胶([ALG] = 10 mg/mL,[PI]= 0.5 yg/mL, [GOx] = 0.067 yg/mL, [GPI] = 0.56 yg/mL, [R848] = 0.8 yg/mL)(溶 于0.1xPBS, [Ca2+] = 1.8 mM)加入到transwell上室中,其中聚碳酸酯支持膜的 孔径为3.0ym,然后将上室安装到transwell板的下室中,并在37C和5% CO2条 件下共同培养24小时。之后,将下室中的M2细胞用PBS轻轻洗涤2次,收集 细胞并将其重新悬浮在500 yL PBS中。取5 yL anti-CD11b-APC和anti-CD86-PE 加入到上述细胞悬液中,避光孵育 30 分钟进行染色。然后离心、洗涤以去除多 余的抗体,再次重悬于 PBS 溶液中进行流式细胞分析。同时,取 5 yL 的 anti- CD11b-APC和anti-CD206-FITC加入到另一组经同样处理的细胞中,孵育30 min 后上机进行流式细胞检测。此外,我们还收集了下室中各组巨噬细胞的上清液进 行ELISA分析,以测定培养基中TNF-a、IL-6、IL-10和IL-12p40的含量,其中 用 PBS 处理的巨噬细胞组作为对照组。
4.2.9 动物模型
107
所有动物实验均由东华大学动物伦理委员会(IACUC)的批准,按照国家卫 生部的相关政策进行。使用3-4周龄的雌性BALB/c裸鼠(上海斯莱克实验动物 有限公司),采用先前报道的方法构建4T1皮下瘤模型[37]。当肿瘤体积达到约100 mm3时,进行体内治疗。采用健康的ICR小鼠研究所研制水凝胶的体内凝胶行 为。
4.2.10体内治疗
将4T1荷瘤裸鼠随机分为7组,每组6只,分别用PBS (对照组),ALG, PI@ALG, GOx@ALG, GPI@ALG, R848@ALG 或 GPI/R848@ALG([GPI] = 0.7 mg/kg, [R848] = 1 mg/kg)进行处理,每只小鼠瘤内注射25 |iL不同的样品。每3 天记录一次肿瘤体积和体重。第15 天,每组各随机处死一只小鼠,取其肿瘤组 织进行苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin staining,H&E)和 TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)染色以观察肿瘤组织的病理变化。同时,获取注射部位 的周围皮肤和心、肝、脾、肺和肾等主要器官进行H&E染色,以评估各治疗组 的生物相容性。
4.2.11统计学分析
通过IBM SPSS统计软件(IBM,Armonk,NY)评估各组实验数据的显著 性差异。选择0.05作为显著性水平,所有数据分别标记为(*)表示p < 0.05,
(**)表示p < 0.01,(***,表示p < 0.001。所有实验数据均用平均值土标准偏差 来表示(n > 3)。
4.3结果与讨论
4.3.1 GPI NPs的合成与表征
表4-2. PI NPs和GPI NPs的水动力学粒径、PDI、表面电势及各组分的含量
Samples Hydrodynamic size
(nm) PDI Zeta potential
(mV) Polyacrylic acid (wt%) Fe3O4
(wt%) GOx (wt%)
PI 21 土 0.0 0.18 -25 土 1.3 19.5 81.5 ---
GPI 35 土 0.2 0.24 -32 土 0.4 16.6 71.6 11.8
 
GPI纳米颗粒采用两步法合成。首先以Fe2+和Fe3+作为前驱体,以聚丙烯酸 作为稳定剂,通过简单的共沉淀法制备得到PI NPs[33]o然后通过EDC (N-(3- dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide)活化聚丙烯酸上的羧酸基团(-COOH), 使其与GOx的氨基(-NH2)发生反应,从而将GOx连接到PI NPs表面形成GPI
108
 
NPs。
通过动态光散射(DLS)法表征了制备的PI NPs和GPI NPso如表4-2和图
4-2A所示,PI NPs的水动力直径为21 土 0.0 nm, PDI为0.18,表面电势为-25 土
1.3mVo经GOx改性后,GPI NPs的水动力学粒径增加到了 35 土 0.2 nm,表面 电势降低至-32 土 0.4 mVo PI和GPI之间水动力学直径的增加(~14 nm)和表面 电势的降低(~7 mV)证明GOx已成功连接到了 PI NPs表面。透射电子显微镜 (TEM)图像显示,PI和GPI NPs均呈现均匀分布的球形形态(图4-2B-C),尺 寸约为3.7 nm。值得注意的是,PI和GPI NPs的水动力学粒径远大于TEM观察
到的尺寸,这可能是由于DLS测量的水动力学直径包括了扩展的聚丙烯酸水分 子层,而TEM测量的仅是干燥状态下的NPs粒径。接下来,利用傅立叶变换红 外光谱(FTIR)分析进一步验证了 GPI NPs的形成。如图4-2D所示,PI NPs在 560 cm-1 (Fe-O)、1555 cm-1 (COO-的不对称拉伸振动)和 1709 cm-1 (C=O 的拉 伸振动)处的典型吸收峰以及GOx在1650 (C=O拉伸振动)和1535 cm-1 (多肽 链的N-H平面内弯曲和C -N拉伸模式)处的吸收峰[38 ]均出现在了 GPI NPs的 FTIR光谱中,表明GOx成功连接到了 PI NPs上。另外,我们使用邻菲罗啉测 定法(Phenanthroline assay)(表 4-2)定量分析了 Fe3O4在 PI 和 GPI NPs 中的含 量,分别为81.5 wt%和71.6 wt%。还通过标准的BCA检测试剂盒定量分析并计
 
图4-2. PI NPs和GPI NPs在水溶液中的水动力学粒径分布(A)及相关系数(插图);PI
NPs (B)和GPI NPs (C)的TEM图片;GOx, PI和GPI NPs的傅里叶变换红外光谱图
(D);不同浓度的 ALG 溶液([ALG] = 5、10 或 20 mg/mL)在 Ga2+ ([Ca2+] = 1.8 mM)
存在下制备的ALG水凝胶(E)和GPI@ALG水凝胶(F)的流变特性([GPI] = 0.5
mg/mL)。
109
 
4.3.2 GPI@ALG 水凝胶的合成与表征
根据先前的报道,我们选用了三种浓度的海藻酸盐([ALG] = 5、10和20 mg/mL)来研究水凝胶的形成过程[32]。流变学结果表明(图4-2E-F),储存模量 (G') >损耗模量(G"),说明无论是否掺杂GPI NPs, ALG溶液在给定的浓度 范围内均可以在含Ca2+的PBS溶液(0.1XPBS, [Ca2+] = 1.8 mM)中快速形成水 凝胶,而且其机械性能随着ALG浓度的增加而增加。我们发现,在相同的ALG 浓度下,GPI@ALG水凝胶比未负载GPI的ALG水凝胶显示出了更低的模量, 这可能是由于聚丙烯酸与海藻酸盐会竞争螯合钙离子的作用。扫描电子显微镜 (SEM)结果表明,ALG水凝胶表面比较光滑,而GPI@ALG水凝胶显示出比 较粗糙的表面,表明GPI NPs成功负载在了凝胶结构内(图4-3A-B)。值得注意
地是,由于浓度为20 mg/mL的ALG水凝胶表现出了最高的模量,因此其类液 体行为减少,流动性较差。于是我们选择5和10 mg/mL的海藻酸钠制备的水凝
胶来研究后续的体内凝胶行为。
AALG ALG ALG
5 mg/mL 10 mg/mL 20 mg/mL
4.3.3水凝胶的体内成胶性能分析
在健康的 ICR 小鼠体内研究水凝胶在生理环境中的体内凝胶行为。将 Cy7 标记的 ALG 溶液或混合了 Cy5 标记的 GPI NPs 的 ALG 溶液分别皮下注射到小 鼠背部的左侧和右侧。然后用小动物荧光成像系统(I VIS)监测其体内凝胶行为。
110
 
如图4-4A-B所示,皮下注射后,ALG和GPI@ALG溶液能够在体内转化为水凝 胶,并在注射部位至少保留 4 天。其中我们注意到, ALG 浓度为 5 mg/mL 的 GPI@ALG成胶性能不太理想,发生了明显的扩散现象,这可能归因于其更具流 动特性,扩散到周围组织的药物会对健康组织造成毒副作用。
 
图4-4.将不同浓度的Cy7-ALG (A)和Cy5-GPI@ALG (B)皮下注射到ICR小鼠体内, 利用小动物荧光成像监测注射后不同时间点时的凝胶成胶行为。瘤内注射Cy5-GPI NPs或
Cy5-GPI@ALG溶液后6 h时4T1肿瘤切片的荧光图片(C),细胞核用DAPI进行染色
(蓝色)。 [ALG] = 5 或 10 mg/mL, [GPI] = 0.5 mg/mL。
DAPI Cy5-GPI Merged
 
图4-5.瘤内注射Cy5-GPI NPs或Cy5-GPI@ALG溶液后第6天4T1肿瘤切片的荧光图
片,细胞核用 DAPI 进行染色(蓝色),[ALG] = 5 或 10 mg/mL, [GPI] = 0.5 mg/mL。
111
 
利用荷瘤裸鼠模型研究了在肿瘤组织内的体内凝胶行为。将Cy5-GPI NPs和 不同ALG浓度(5和10 mg/mL) 的 Cy5-GPI/ALG溶液注射到肿瘤内部。分别 在注射后6 h和6 d,手术切除肿瘤并切片处理,以观察Cy5标记的GPI NPs在 肿瘤内的分布情况。从图4-4C看到,在注射后6小时,Cy5标记的free GPI NPs 和不同浓度的GPI@ALG水凝胶([ALG] = 5和10 mg/mL)均匀的分散在整个肿 瘤组织中。注射后第6天,在free GPI NPs组和[ALG] = 5 mg/mL的GPI@ALG 凝胶组中几乎没有观察到红色荧光,而当[ALG] = 10 mg/mL时,在肿瘤组织内 仍然保留了一定程度的荧光分布,说明该浓度的 ALG 制备的水凝胶可以限制 Cy5-GPI NPs的扩散,使其在肿瘤组织滞留更长时间(图4-5)。因此,考虑到均 匀的瘤内分布和较长的肿瘤滞留时间,我们选择10 mg/mL的ALG浓度进行后
 
4.3.4 催化活性评价
为了考察GPI NPs催化葡萄糖转化为葡萄糖酸和H2O2的催化活性,我们首 先检测了 GOx是否能使葡萄糖溶液的pH值降低[39]。如图4-6A所示,GOx和 GPI NPs均能在2 h内将葡萄糖溶液(2 mg/mL)的pH值从7.4降低到4左右, 表明在合成GPI NPs的过程中GOx的酶活性没有受到显著影响。更重要的是, 在该pH值下更有利于促进Fe2+/Fe3+的释放,从而可以增强Fe3O4介导的Fenton 反应[15]。另外,还研究了 GOx、 GPI 和 GPI@ALG 水凝胶在葡萄糖存在下产生 H2O2的特性。从图4-6B可以清楚地看到,GPI NPs产生H2O2的速率和能力与 GOx 本身十分接近,而 GPI@ALG 水凝胶则表现出了延迟的生成速率,这可能 是因为ALG水凝胶结构阻碍了葡萄糖进入凝胶内部与GOx的接触。接下来,使 用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)作为指示剂,评估通过级联芬顿反应生成,HO 的情况。无色的TMB可以被・HO氧化生成蓝色产物,该产物在650 nm处具有
112
最大吸收值。从图4-6C可以看出,在pH = 7.4或5.0、100 pM的肿瘤区域H2O2 浓度下均未检测到明显的TMB氧化,说明肿瘤区域的H2O2浓度较低,难以有 效地生成・HO。然而,加入了葡萄糖(5 mM)以后观察到显著的蓝色产物,650 nm处的吸收值也明显升高,这表明GOx通过氧化葡萄糖,增加H2O2的浓度显 著提高了・HO的生成。而且值得注意地是,酸性pH值条件(pH 5.0)和葡萄糖
(5 mM)的存在进一步提高了・HO的产量。这些结果表明,合成的GPI NPs能 够有效地催化葡萄糖转化生成葡萄糖酸和H2O2,从而有助于Fenton反应介导 的・HO的生成。
 
4.3.5细胞毒性和细胞吞噬性能分析
GPI NPs对4T1细胞的细胞毒性影响通过CCK-8法进行评估,PI NPs和GOx 作为对照组。如图4-7A所示,合成的PI NPs在研究浓度范围内没有产生明显的 细胞毒性。而用浓度为18 ng/mL的GOx处理的4T1细胞存活率下降到79%,可 能是由于葡萄糖的消耗和有毒的H2O2的产生。当GOx浓度高于6 ng/mL时,经 GPI NPs孵育的4T1细胞的细胞活力显著低于free GOx处理的细胞,这表明形 成的GPI NPs对癌细胞具有更好的杀伤效果。而且,GPI在75 ng/mL的低浓度 (对应的GOx浓度为9 ng/mL)下即可以充分杀死癌细胞。通过计算得出,GPI 对4T1细胞的半数抑制浓度(IC50)为37 ng/mL。然后,使用钙黄绿素/碘化丙啶
113
(Calcein-AM/PI)染色(Calcein-AM标记活细胞为绿色,PI标记死细胞为红色) 进一步观察4T1细胞的凋亡情况。从图4-7B中清楚地看到,用GPI NPs孵育的 4T1细胞显示出最高的细胞死亡率,与CCK-8结果一致。考虑到・HO的寿命比 较短且有效范围有限,我们接下来考察了 GPI NPs在癌细胞内的吞噬行为。如图 4-7C 所示,培养 2 小时后,我们在 GPI NPs 组处理的细胞质中观察到了明显的 红色荧光,证明GPI NPs可以被吞噬到4T1细胞内。
以2',7'-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)作为荧光指示剂,进一步研究 了细胞内・HO的产生情况。没有荧光的DCFH-DA被细胞内的活性氧氧化,发 出绿色荧光。从图4-8可以清楚地看出,GPI治疗组的绿色荧光显著高于其他 各治疗组,说明GPI组产生的・HO量最多。因此,综合上述体外细胞毒性实验 表明, GPI NPs 有望用作癌症治疗的催化纳米药物。
 
 
([GOx] = 12 口g/mL), scale bar = 50 gm。
4.3.6肿瘤相关巨噬细胞的体外复极化性能分析
由于致瘤信号分子的过度产生,TAMs主要表现为类似于M2型巨噬细胞的 免疫抑制和促进肿瘤生长的功能,主导肿瘤的进展和转移[40,41]。因此,促进TAMs 从M2表型向M1型的复极化有望增强抗肿瘤治疗效果。根据前面提到的,Fe3O4 NPs可以通过诱导与干扰素调节因子5 (IRF5)途径相关的巨噬细胞发生表型转 化,而Toll-样受体激动剂R848主要通过激活核因子kB (NF-kB)信号通路使 M2巨噬细胞极化为M1表型[25,28]。Fe3O4和R848的联合使用有望获得更好的 TAMs极化效果。因此,在该体系中,我们将R848复合到GPI@ALG水凝胶中 以缓解肿瘤微环境的免疫抑制和致瘤特性。首先,通过记录320 nm处的紫外吸 收变化,监测R848在不同pH值条件下从GPI/R848@ALG水凝胶中的累积释放 行为。如图4-9所示,在48 h监测时间内,当pH = 7.4时仅有44.8%的R848从 水凝胶中释放出来,而在酸性pH条件下,R848的累积释放量分别显著增加至
114
76.4% (pH = 6.5)和84.7% (pH = 5.5)。考虑到酸性肿瘤微环境和GOx介导葡 萄糖酸的产,这种pH响应性的药物释放行为可能有利于R848在肿瘤微环境中 的释放,从而增强GPI/R848@ALG水凝胶的抗肿瘤作用。
 
 
图 4-9.在不同 pH 条件下(pH 7.4, pH 6.5 和 pH 5.5) R848 从 GPI/R848@ALG 水凝胶中
的累积释放行为。
然后,我们利用流式细胞术研究了不同配方的水凝胶在促进TAMs复极化方 面的能力。首先,将RAW264.7巨噬细胞与IL-4 (40 ng/mL)预先孵育24小时 以诱导成为M2型巨噬细胞。然后在transwell系统中,通过流式细胞术(FACS) 和酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)分析M2型巨噬细胞向M1表型的复极化情 况。从FACS结果(图4-10A-D)看到,与其他组相比,PI@ALG, GPI@ALG, R848@ALG 和 GPI/R848@ALG 处理 24 h 后使 CD11b+CD86+细胞(M1 型巨噬 细胞)的比例增加,CD11b+CD206+细胞(M2型巨噬细胞)的比例减少,表明磁 性Fe3O4和R848都可以有效地使TAMs从M2表型逆转为M1表型,这与先前 的报道一致[24,25,42]。其中,经 GPI/R848@ALG 处理的巨噬细胞在所有组中表现 出了最高的M1型比例(63.0%)和最低的M2型比例(14.4%),这意味着PI和 R848的结合进一步促进了 TAMs的逆转。而且,经计算得出,GPI/R848@ALG 组的M1/M2比例为4.38 土 0.06,比PBS组高8.59倍(图4-10E)。
为了进一步确认不同配方的水凝胶对 TAMs 的复极化效果,我们还收集了 transwell 下室中的细胞上清液,并使用 ELISA 试剂盒测定相关细胞因子的分泌 水平。如图4-10F-I所示,GPI/R848@ALG与TAMs孵育24后导致了 TNF-a、 IL-6 和 IL-12p40 等促炎型细胞因子(由 M1 巨噬细胞分泌)的上调和抑炎型细 胞因子IL-10 (由M2巨噬细胞分泌)的下调,进一步说明GPI/R848@ALG可以 有效地将TAMs从M2表型复极化为M1型。这些结果表明,Fe3O4与R848联合
115
 
使用可以获得更好的TAMs复极化效果,从而将肿瘤支持型微环境转变为肿瘤抑 制型状态,为进一步增强抗肿瘤治疗提供了的巨大可行性。
 
图4-10.利用transwell系统考察了肿瘤相关巨噬细胞(TAMs,用40 ng/mL的IL-4预处理
24 h得到)经不同材料处理24 h后的体外复极化特性。不同材料处理后M1型巨噬细胞 (CD11b+CD86+ )和M2型巨噬细胞(CD11b+CD206+)的流式细胞分群结果(A)。在 transwell装置中利用不同组分的水凝胶诱导TAMs分型的设计示意图(B), CD11b+CD86+
(C)、CD11b+CD206+ (D)细胞的百分数及巨噬细胞M1/M2的比例(E)。经不同材料处
理后巨噬细胞培养基上清液中相关细胞因子(TNF-a, IL-6, IL-10和IL-12p40)的分泌情
况(F-I), ***p < 0.001 o
4.3.7 体内抗肿瘤治疗
GPI NPs 的有效催化活性和优异的体外治疗性能为我们进一步使用 4T1 荷 瘤裸鼠模型评估体内抗肿瘤治疗效果奠定了基础。当肿瘤体积达到100 mm3左 右时,将荷瘤小鼠随机分为7组,每组6只小鼠,分别在瘤内注射25 pL PBS(对 照组)、ALG、PI@ALG、GOx@ALG、GPI@ALG、R848@ALG 或 GPI/R848@ALG 溶液,其中ALG的浓度为10 mg/mL, GPI和R848的注射剂量分别为0.7 mg/kg
116
和 1 mg/kg (图 4-11A)。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图4-11. 4T1皮下瘤模型的建立和体内治疗示意图(A),每只小鼠注射体积25 pL,其中
[ALG] = 10 mg/mL, [GPI] = 0.7 mg/mL, [R848] = 1 mg/kg。治疗 15 天后的小鼠肿瘤体积照
片(B),不同治疗过程中的相对肿瘤体积变化(V/V。, n = 6) (C)和4T1荷瘤小鼠的存活
率(n = 5) (D)。治疗15天后各组小鼠肿瘤切片的H&E (scale bar = 500 gm)和TUNEL
(scale bar = 200 gm)染色照片(F)。在不同治疗过程中4T1荷瘤小鼠的体重变化(F)。
通过记录肿瘤体积变化以评估治疗结果(图4-11B-C)。我们发现ALG和 PI@ALG 治疗组表现出与 PBS 组类似的肿瘤生长曲线,肿瘤的生长速度未受到 明显的抑制。由于 GOx 可以通过消耗葡萄糖阻断肿瘤细胞的营养来源,因此 GOx@ALG治疗组在一定程度上抑制了肿瘤的生长。将GOx与FesO4 NPs进一 步结合,使GPI@ALG比GOx@ALG表现出了更明显的肿瘤抑制效果,这可以 归因于葡萄糖的消耗和增强的化学动力学治疗相结合的结果。此外,值得注意地 是, R848@ALG 治疗组比较明显地抑制了肿瘤的生长,这可能是由于 R848 将 TAMs从促进肿瘤生长的M2表型重新极化为了抑制肿瘤生长的M1表型所致。 更重要的是, GPI/R848@ALG 治疗组与所有其他组相比,显示出了最小的肿瘤 体积大小和最显著的肿瘤抑制效果,这应该归因于(1) GOx 介导的饥饿疗法、
117
(2) Fe3O4介导的增强型化学动力学治疗以及(3) Fe3O4和R848诱导TAMs复 极化的协同作用。在体内治疗结束(第15天)后,从各治疗组随机取一只小鼠 进行安乐死,获取各组小鼠的肿瘤,拍照、固定、切片并进行H&E和TUNEL染 色。每组剩余的 5 只小鼠继续喂养以计算各组小鼠的存活率。结果发现, PBS、 ALG、PI@ALG和GOx@ALG组的小鼠在第24天时已全部死亡,而GPI@ALG 和 R848@ALG 组的小鼠存活率在治疗后45 天分别为 20%和 40%, GPI/R848@ALG 组的小鼠存活率最高,在 45 天时仍然达到 60%(图 4-11D)。 H&E和TUNEL染色结果(图4-11E)也显示,GPI/R848@ALG治疗组的肿瘤坏 死和凋亡率最高。因此,上述体内治疗结果均表明GPI/R848@ALG水凝胶对皮 下 4T1 肿瘤模型具有显著提高的抗肿瘤效果。
4.3.8 体内生物相容性评价
为了评估GPI/R848@ALG水凝胶在体内治疗过程中的生物安全性,首先监 测了治疗过程中4T1荷瘤裸鼠的体重变化。如图4-11F所示,所有治疗组均未观 察到明显的体重下降。另外,考虑到GPI NPs具有较高的细胞毒性,我们在治疗 结束后第15天还采集了注射部位的外周皮肤并进行H&E组织学检查。从图4- 12 中看到,水凝胶的注射并未对表皮和真皮层产生任何明显的形态学变化,这 表明水凝胶对周围组织具有良好的生物相容性。同时,还通过对治疗结束后小鼠 主要器官的 H&E 染色分析,进一步评估了不同组分水凝胶的体内生物安全性。 如图4-13所示,与PBS对照组相比,我们在各治疗组中均未观察到如炎症浸润、 形态学改变和坏死等明显的病理异常,表明不同配方的水凝胶具有较低的全身毒 性和良好的生物相容性。
 
图4-12.在裸鼠背部皮下注射水凝胶后第15天,注射部位皮肤组织的H&E染色图片。未
经任何处理的小鼠作为对照组。每只小鼠注射体积25心,其中[ALG] = 10 mg/mL, [GPI]
=0.7 mg/mL, [R848] = 1 mg/kg。Scale bar = 200 gm。
 
118
 
 
 
4.4本章小结
本章我们构建了一种多功能型可注射水凝胶,用于进行癌症的饥饿治疗、化 学动力学治疗和肿瘤相关巨噬细胞的复极化。在瘤内注射后, ALG 溶液通过与 TME中自然存在的Ca2+离子之间的络合作用转化成为水凝胶,从而将治疗性试 剂GPI NPs和R848递送并局限在肿瘤区域内。GPI/R848@ALG水凝胶可以通过 GOx催化葡萄糖转化为葡萄糖酸和H2O2,切断肿瘤内的葡萄糖供应,实现饥饿 治疗。产生的葡萄糖酸和H2O2通过Fe2+/Fe3+介导的Fenton反应促进高毒性・HO 的产生,从而有效增强化学动力学治疗效果。另外,通过在水凝胶内同时负载 Fe3O4 NPs和R848,使GPI/R848@ALG治疗组取得了最高的 M1/M2 比率(4.38), 同时上调了 M1型相关细胞因子(TNF-a、IL-6和IL-12p40)的分泌。体内实验 表明GPI@ALG水凝胶可以有效抑制4T1肿瘤的生长。由于Fe3O4 NPs和R848 还可以诱导TAMs从肿瘤支持型的M2表型向肿瘤破坏型的M1表型逆转,因此 GPI/R848@ALG 水凝胶进一步提高了抗肿瘤治疗效果并延长了荷瘤小鼠的存活
119
率。总而言之,该设计提供了一种新的治疗策略,通过多功能化的可注射水凝胶 将治疗性试剂递送并局限在肿瘤位置,从而降低了对正常组织的毒副作用,并结 合肿瘤饥饿疗法、增强的化学动力学治疗和辅助TAMs复极化作用来协同增强抗 肿瘤效果。
参考文献
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