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CdSe/ZnS 量子点纳米药物载体的合成及其抗肿瘤活性研究

发布时间:2022-11-09 11:11
摘 要 I
ABSTRACT III
1 引言 1
1.1.1量子点的概念 1
1.1.2量子点相较于传统荧光染料的优点 2
1.2量子点的合成方法 3
1.2.1有机相合成法 3
1.2.2水相合成法 4
1.3量子点表面功能化修饰方法 5
1.4量子点在生物医学方面的应用 6
1.4.1细胞成像 7
1.4.2生物活体成像 7
1.4.3在药物研发中的应用 8
1.4.4生物芯片方面的应用 9
1 .5课题研究目的、意义和内容 1 0
1.5.1课题的研究目的和意义 1 0
1.5.2课题研究内容 1 0
参考文献 13
2 二氢硫辛酸修饰的量子点药物载体的合成及其抗肿瘤活性研究 23
2.1前言 23
2.2实验部分 25
2.2.1主要试剂 25
2.2.2主要仪器 26
2.2.3主要溶液的配制 26
2.2.4CdSe/ZnS量子点的合成及修饰 27
2.2.5合成 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系 29
2.2.6CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系的表征 30
2.2.7CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT载药体系体外性质研究 30
2.2.8细胞的培养 3 1
2.2.9细胞毒性检测 3 2
2.2.10细胞成像 3 3
2.2.11对细胞凋亡的影响 3 3
2.2.12对细胞自噬的影响 3 3
2.2.13 对细胞线粒体膜电位的影响 3 4
2.2.14对细胞中活性氧含量的影响 3 4
2.2.15生物体内分布 3 4
2.2.16对肿瘤的抑制效果 35
2.3结果和讨论 35
2.3.1紫外荧光及红外表征结果 35
2.3.2透射电镜检测结果 3 6
2.3.3Zeta 电位检测结果 37
2.3.4药物释放结果 3 7
2.3.5载药率和包封率检测结果 38
236 MTT检测结果 39
2.3.7细胞成像结果 40
2.3.8细胞凋亡检测结果 4 1
2.3.9细胞自噬检测结果 4 1
2.3.10细胞线粒体膜电位检测结果 42
2.3.11细胞中活性氧含量检测结果 43
2.3.12体内分布情况检测结果 43
2.3.13抑瘤实验结果 44
2.3.14小鼠心肝脾肺肾以及瘤的H&E染色切片 45
2.4本章小结 46
参考文献 47
VIII
3.肝癌靶向的超支化聚酰胺胺修饰的量子点双载药体系的合成及其活性研究 49
3.1 前言 49
3.2实验部分 52
3.2.1主要试剂 52
3.2.2主要仪器 52
3.2.3主要溶液的配制 52
3.2.4CdSe/ZnS量子点的合成 52
3.2.5超支化聚酰胺胺的合成 52
3.2.6载药纳米粒子合成步骤 5 3
3.2.7纳米载药体系的表征 56
3.2.8细胞的培养 56
3.2.9细胞毒性检测 56
3.2.10竞争性抑制摄取检测 56
3.2.11细胞成像 5 7
3.2.12对细胞凋亡的影响 5 7
3.2.13对细胞自噬的影响 5 7
3.2.14对细胞线粒体膜电位的影响 5 7
3.2.15对细胞活性氧含量的影响 5 7
3.2.17 对肿瘤的抑制效果 5 7
3.3 结果与讨论 5 7
3.3.1超支化聚酰胺胺的核磁结果表征 5 7
3.3.2纳米载药体系的紫外和荧光表征 5 9
3.3.3纳米载药体系的形貌 5 9
3.3.4纳米载药体系的Zeta电位 60
3.3.5细胞毒性实验结果 61
3.3.6纳米载药体系的细胞成像结果 62
3.3.79R-P201肽竞争性摄取检测结果 64
3.3.8对细胞凋亡的影响结果 65
3.3.9对细胞自噬的影响结果 66
3.3.10对细胞线粒体膜电位的影响结果 67
3.3.11对细胞活性氧含量的影响结果 67
3.3.12纳米载药体系的小鼠体内分布结果 68
3.3.13纳米载药体系对肿瘤的抑制效果 69
3314 H&E染色以及TUNEL染色结果 70
3.4 本章小结 7 1
参考文献 73
4 总结与展望 75
附录 A cHCPT的氢谱图 77
附录B cHCPT的碳谱图 79
附录C cHCPT的质谱图 81
致 谢 83
1 引言
癌症以其高发病率和高死亡率对人类的健康和生命构成严重威胁[1],传统的临床手 术、放疗、化疗存在易复发、靶向性差、多药耐药、副作用严重等缺点[2],因此选择功 能性的纳米药物载体是解决这些问题的一个良好突破口[3]。纳米药物载体由于其独特的 增强渗透性和滞留性(EPR)效应⑷,在提高抗肿瘤药物生物利用率,增强疗效以及减 少毒副作用方面发挥着重要作用[5]。而且新型纳米载药体系为可控的药物递送和联合治 疗方法提供了机遇[6],随着各种成像技术和治疗方法的发展,这些纳米载体在成像引导 的癌症治疗中表现出极大的应用场景[7]。
这些纳米载体材料中,量子点具有宽的吸收带和窄的发射带,较长的荧光寿命,大 的斯托克斯位移和良好的生物相容性等优势[8,9],量子点的这些独特性质在生物医学领 域引起了广泛的关注,并被应用于组织成像、诊断、单分子探针和药物输送等领域[10], 逐渐成为纳米医学中不可或缺的材料之一。
1.1量子点
1.1.1量子点的概念
量子点是由半导体材料制成的纳米晶体,通常由周期表中第III族或第III-V族元素 的原子组成[11]。量子点的颜色与它的粒径大小有关,而它的粒径大小和性状可以通过反 应时间的长短,温度的高低,配体的不同来控制[12-14]o量子点的核心通常由硒化镉(CdSe)、 碲化镉(CdTe)或磷化铟(InP)组成[15\最常用的量子点是由硒化镉(CdSe)核制成的,因为 它们显示出更高的量子产率。量子产率是荧光分子亮度的指标,它被表示为发射的光与 被荧光团吸收的光的比例[16]o CdSe核通常被硫化锌(ZnS)壳覆盖,以增加对光漂白的抗 性并增加量子产率[17,18]。电子从基态跃迁到激发态所需的能量来自如紫外光等的外部光 源。而电子从激发态到基态的距离我们通常称为带隙。电子发射的能量高低与带隙大小 有关,两者呈正比关系。尺寸较小的量子点具有的带隙较大[19],因此,它们发射出更高 频率的波长,显蓝紫光。而尺寸较大的量子点具有的带隙较小,因此,它们发出波长的 频率较低,显红橙光(图 1-1)[20]。
量子点的激发光谱很宽,可以在很宽的波长范围内激发[21-23]。量子点的这种特性的 
优势就体现在当需要用不同颜色区分标记组织或其他分子时,只要有一个单一光源就可 以激发样品中存在的所有不同尺寸的量子点,并发出不同颜色的光,能够很好的对标记 物进行区分。而传统的有机染料的激发光谱很窄,这意味着它们需要用特定波长的光进 行激发,在需要区分多组分时,效果就不是很理想[24]。量子点的发射光谱取决于它的尺 寸大小和组成结构,这使得量子点能够成为非常好的的标记物[25],因为量子点窄的发射 波长可以容易地被识别并彼此分离。量子点宽的激发光谱和窄的发射光谱特性使它们可 用于多色成像,因为一个光源就可以同时激发所有不同尺寸的量子点中的基态电子,而 且不同大小的量子点发射的荧光可以彼此区分开来[26-28]。
 
图 1-1 量子点独特的光学性质 [20 ]
 
1.1.2量子点相较于传统荧光染料的优点
在荧光成像方面,量子点具有稳定性、长期成像和易于区分的特点[29],这也是选择 量子点而不是荧光染料的三个主要原因。
有机染料的荧光成像容易受到光漂白、低信号强度和光谱重叠的影响[30],基质极 性、粘度、pH和离子强度以及存在表面活性剂等微环境会影响有机染料的光谱位置, 荧光寿命和吸收和发射带的强度,这些限制阻碍了它们在多通路生物成像中的应用[31]。 有机荧光团如罗丹明(Rh)、荧光素硫氰酸酯(FITC)和四甲基罗丹明硫氰酸酯(TRITC)等暴 露在光下仅几分钟后就褪色,但是量子点非常稳定,可以在高亮度和无光褪色的情况下 经历激发和荧光的重复循环数小时[32]。
量子点具有很强的光致发光强度和光稳定性,使得检测到的图像更明亮和稳定。而 且量子点还可以根据需要调整大小,从而能够发出不同颜色的光[33,34]。此外,量子点很 
容易被激发,这是因为任何低于其发射波长的光都可以激发它们,而不是某个激发范围 的波长才能被激发。量子点更容易区分,这是因为不同的尺寸以及较窄的发射光谱,从 而能够激发量子点发出不同的颜色(图 1-2)[35]。最后,与有机染料相比,量子点更容易 官能化[36]。
综上所述,与传统的有机染料和荧光化合物相比,量子点具有许多优势。然而,当 量子点应用于生物医学领域时,还需要考虑一些方面,比如量子点的水溶性和毒性[37]。
Near-infrared
 
图 1-2 有机染料和量子点的结构特性以及发射波长对比图 [ 35 ]
 
1.2量子点的合成方法
我们只有制备出具有宽的吸收带,窄且对称的发射峰,高的荧光量子产率和良好生 物相容性的稳定量子点,才能更好地发挥其优势,应用于生物医学领域。量子点的合成 常用的有两种方法,一种是“有机相合成法”,另外一种则是“水相合成法”[38]。
1.2.1有机相合成法
在有机相制备量子点主要采用的方法是有机金属法(图 1-3)[39];即在配体存在的 条件下,金属有机物在高温下发生了热分解,然后通过快速成核和慢速生长的过程得到 的量子点。将定量的有机金属前驱体溶液在300 °C左右的高温下注入配体溶剂中,反应 体系的温度迅速下降,从而使得使有机金属前驱体达到过饱和状态,发生晶核爆发形成 大量的晶核。然后当有机金属前驱体被消耗完后,将反应温度骤降到200 C以下,终止 成核反应,量子点开始慢速生长。常用的前驱体主要为烷基金属或烷基非金属化合物, 
主配体可选择三辛基氧化膦(TOPO),十二胺(DDA),吡啶或咲喃等,溶剂兼次配体为 三辛基膦(TOP)40〕。有机相合成法制备的量子点种类多,荧光量子产率高,光学性能 优异,粒径可控,是目前制备量子点的主要方法[41]。
目前,量子点有机制备有了新的发展趋势:一个是对合成方法进行改革,比如选用 油酸,液体石蜡等替代三辛基氧化膦,三辛基膦等,这样合成的成本更低,而且毒性更 低,更环保[42〕。另一个是改变合成量子点的结构,量子点从一开始的单核结构,改变为 核壳式结构,近年来科学家们开始合成混晶多元量子点[43〕。混晶多元量子点通常是由改 变前体的组成比例来调控的,这样的话在操作时更容易控制,而且精确度更高,最重要 的是合成的混晶多元量子点具有更加优异的光学性能 [44,45〕。
 
图 1-3 量子点的有机合成示意图 [ 39〕
 
1.2.2水相合成法
有机相中制备的量子点是需要经过水溶性修饰才能应用于生物医学领域,但是转水 之后的量子点荧光强度会降低,甚至可能会发生荧光淬灭现象[46〕。而水相法合成的量子 点水溶性较好,不需要进一步转水修饰,此外,该方法操作简单,成本低廉,因而近年 水相合成法成为人们研究的热点[47〕。
水相合成法:水相合成法主要用于离子性较强的11-^族量子点的合成。采用的配位 剂一般是巯基小分子,在水溶液中通过共沉淀反应合成量子点[48〕。配位剂含有的巯基配 位结合在量子点表面的金属离子上,而它所带的其他基团,如NH2,COOH,OH等保 证了量子点的水溶性。而且稳定剂所带的官能团[49〕,对量子点表面电荷及其他特性的控
4
制十分重要[50]。
该方法的原理:选用离子型前驱体,如Zn2+, Cd2+,Hg2+等阳离子或是Se2-,Te2-等 阴离子;配体则含有巯基的多官能团小分子,如巯基乙醇,巯基乙酸,巯基乙胺等,反 应介质是水溶液[51]。水相合成法有很多的优点,比如该方法以水为反应介质,用普通的 盐作为反应的前体,十分的绿色环保,降低对环境的污染,而且极大的降低了反应成本
[52]。但是水相合成法也有缺点,比如合成的量子点荧光强度不高[53],荧光半峰宽较油 相合成的量子点宽,合成的量子点稳定性较差等。针对以上问题,科学家们对合成方法 进行了改进,合成的量子点的量子产率有所提高,稳定性也有加强[54-58]。
1.3量子点表面功能化修饰方法
量子点具有优良的荧光特性[59],这些特点使其能够广泛应用于靶向载药,生物成像 等方面。但同时量子点也具有一些缺点,如水溶性差,生物相容性不好,这会影响体内 的转运和对细胞的特定靶向作用[60],量子点含有的重金属离子还会引起生物毒性,因 此,我们需要对量子点进行表面功能化修饰(图 1-4)[39],提高其水溶性,降低其毒性, 使其成功应用于生物医学领域[61]。
量子点常用的水溶性修饰方法有三类:
第一种是配体交换法:用带有巯基或氨基基团的小分子,利用巯基或氨基取代量子 点表面的 TOPO 配体,从而使得量子点具有水溶性。如用巯基乙酸上的巯基取代 CdSe/ZnS量子点表面的TOPO配体,巯基上的S可与ZnS中的Zn原子结合,而另一 端的官能团羧基赋予了量子点水溶性[63]。此外,带有大量基团的大分子如树枝状聚合 物,多肽等[64]也可以取代TOPO配体,而且这些大分子带有的氨基或者羧基还可以键 合其他生物分子。
第二种是表面硅烷化法:即先用巯基硅烷化试剂取代量子点表面存在的 TOPO 配 体,然后用其他硅烷化试剂对量子点进行硅烷化水解反应[65],从而量子点表面形成双层 硅氧壳结构。常用的巯基硅烷化试剂是巯基丙基三甲氧基硅烷(MPTMOS) [66],MPTMOS 的巯基基团取代量子点表面的配体,甲氧基硅烷基团通过硅氧烷键的形成而聚合在量子 点表面形成高度交联的保护壳[67]。
第三种则是聚合物包覆法:使用含氨基,羧基的两段或三段型嵌段聚合物,磷酯类 胶束等两亲性的大分子包覆量子点,其疏水端直接与量子点的 TOPO 结合[68],而亲水 
端暴露在外,使得量子点具有水溶性,同时其聚合物带有的官能团可实现量子点的生物
功能化。常用的两亲性聚合物有聚马来酸酐,聚电解质聚丙烯酰胺[69〕,或生物聚合物如
DNA 等[70〕。
 
 
1.4量子点在生物医学方面的应用 量子点独特的荧光性质引起了生物医学领域的广泛关注[71-75〕,如高亮度、抗光漂白
性、多路复用能力和高表面体积比使它们常应用于细胞内跟踪、诊断,在活生物体内成 像和治疗传递等方面(图 1-5)[76-80〕。
 
 
1.4.1细胞成像
在细胞成像方面,量子点主要应用于细胞组织成像以及离体活细胞成像[81-85]。由于 量子点的荧光色与其粒径大小有关,因此可以同时进行多种细胞的多色标记观察(图1- 6)[86];而且量子点的光稳定性很好,不易淬灭,适用于对细胞的生长,发育,凋亡等做 详细观察的实验[87]。此外,可以将抗肿瘤药物与量子点相连,靶向作用于肿瘤细胞,还 可以观察到药物在肿瘤细胞中的作用情况[88-91]。
量子点在细胞标记领域的应用十分广泛[92],量子点常用的细胞标记方法是非特异 性的[93-95],这种方法进行细胞标记时十分简便快速,但这种方式对细胞内的细胞器没有 特异性标记能力,细胞器成像的准确性不高[96]。但是研究发现,当量子点被特定的聚合 物或脂质壳包裹时,减少了非特异性的细胞标记[97-100]。我们可以看到,量子点在生物 医学领域显示出很广阔的发展前景。
 
图 1-6 量子点用于细胞荧光多色标记[86]
 
1.4.2生物活体成像
由于体外细胞培养无法精确模拟活体动物模型的复杂内部环境[101],因此人们开始 研究在量子点在活体成像中的应用[102],这主要包括体外和体内生物成像。通常在活体 成像中用作造影剂的常规荧光染料效果不佳[103-105],具有组织特异性较差、稳定性较低、 光漂白和低的信号穿透性等问题[106]。而量子点所具有的可调控的光学性质、高稳定性, 可表面功能化实现靶向标记的能力等解决了这些问题(图 1-7)[107-115]。
但是,量子点在应用于生物活体成像时还有一些问题需要解决,其中比较重要的就 是量子点的代谢问题,应用于生物体中的量子点能否代谢和排泄完全还需要进一步进行 研究;另一个就是量子点的毒性问题[116-118],由于量子点中含有重金属离子,因而在实 际应用中要考虑其毒性危害[119]。
 
图 1-7 量子点在生物活体成像中的应用 [ 115 〕
1.4.3在药物研发中的应用
量子点在药物研发方面也有很重要的应用,比如药物递送,药物筛选和靶向治疗方 面[120,121〕。将量子点与靶向药物分子相连,药物分子,量子点和靶向分子可以构成靶向 治疗癌症的药物传递系统,可以特异性的将量子点和药物运送到需要特异性标记的部位 [122〕,通过量子点的荧光特性,观察药物的运输传递情况,以及药物在靶向部位的聚集 情况,能够更好点的掌握治疗信息[123〕。此外,还可以用不同的量子点标记两种或两种 以上的药物,这样就可以同时研究多药治疗方式时药物的相互作用情况以及在生物体内 的输送情况[124〕。
冯等研发出了一种高效的癌症免疫疗法[125〕,如图 1-8 所示,功能化的量子点表现 为荧光纳米探针、用于装载疫苗成分的纳米载体和 Nlrp3 依赖性炎症体激活剂。量子点 脉冲树突状细胞(DC)疫苗能够实现淋巴引流的时空追踪和DC免疫疗法的疗效评估,并 触发有效的免疫激活,该研究为肿瘤免疫治疗提供了一种可行的治疗方法。
 
 
1.4.4生物芯片方面的应用
由于量子点的尺寸大小与其荧光色息息相关,且激发宽,发射光谱窄,很容易进行 区分,因此,量子点可以用于对蛋白质,DNA等生物大分子的分析[126]o在使用荧光探 针进行蛋白质的标记时,应用十分受限,一次只能将一种或几种标记了荧光探针的蛋白 质与芯片作用,并进行监测,当有多个蛋白质需要监测时,就需要多次重复试验,效率 十分低。而量子点的出现改变了这一现状,同一激发波长下可以对很多不同粒径,不同 组成的量子点进行激发而发出不同颜色的荧光色进行区分,大大提高了实验效率,由此 可见,量子点对基因组学和蛋白质组学的研究具有非常重要的作用[127,128]。
张等提出了一种基于光子晶体(DBPCs)的高灵敏度和特异性诊断生物芯片[129],该 芯片将量子点的光学优势与光子晶体的仿生周期性纳米结构相结合来实现信号放大,应 用于血液循环中肿瘤外来体的检测。如图 1-9 所示,在这项工作中,他们首先利用链霉 亲和素标记的量子点(QD)结合生物素化的抗GPC1 (磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1, 一种在胰 腺癌外泌体中过表达的膜锚定蛋白),然后外来体上的GPC1通过抗GPC1/QD被特异性 识别。最后,信号放大是通过光子晶体(PCs)的仿生周期性纳米结构实现的,信号强 度与外来体的数量呈正相关。此外,该方法允许通过改变外来体上的标记来定量分析外 来体上的各种疾病特异性表面蛋白。
Without PCs
图 1-9 基于量子点的蛋白质芯片 [ 129 ]
1.5课题研究目的、意义和内容
1.5.1课题的研究目的和意义
癌症严重威胁着人们的身体健康,但是传统的化疗药物取得的治疗效果又不理想, 因此,急需一种新的治疗方法改善这一现状。纳米载药系统完美的弥补了传统化疗药物 的不足,它能改善化疗药物水溶性差,靶向性差,以及毒副作用大的问题。其中量子点 具有良好的荧光性能,以及较大的比表面积,可以对它进行表面功能化,然后负载抗癌 药物和靶向剂,从而得到具有靶向示踪能力的载药体系。
1.5.2课题研究内容
我们选用二氢硫辛酸小分子以及超支化聚酰胺胺大分子对量子点进行水溶性修饰, 制备纳米载药体系。在第一个体系中,我们用二氢硫辛酸对量子点进行修饰后,然后在 转水后的量子点上连接 PEG 构建具有良好生物相容性的纳米载体,最后负载上抗癌药 物HCPT,细胞实验和动物实验均表明该纳米载药体系具有良好的抑瘤效果。然后我们 希望实现纳米载药体系的特异性靶向,更高的载药量,以及双药协同治疗,因此,我们 选用了大分子超支化聚酰胺胺对量子点进行水溶性修饰,得到的量子点水溶性修饰物表 面具有很多的氨基基团,可以负载更多的抗癌药物a-TOS以及PTX实现双载药,肝癌
10 
靶向多肽 9R-P201 的连接使得该载药体系具有肝癌细胞特异性靶向治疗作用,实验结果 显示,相比于其它细胞,该体系对肝癌细胞 HepG2 具有良好的抑制增殖效果,具有靶向 治疗作用,而且抑瘤效果也明显优于单载药体系。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12
 
 
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22
2 二氢硫辛酸修饰的量子点药物载体的合成及其抗肿瘤活性研究
2.1前言
在过去的几十年中,荧光材料在生物医学领域的发展一直在扩大,其中比较常用的 材料就是量子点,目前已被用于成像分析、生物传感器和免疫荧光诊断平台,以及药物 输送等领域[1-6]。
本实验使用二氢硫辛酸对 CdSe/ZnS 量子点进行水溶性修饰,得到的量子点水溶性 修饰物用于构建抗肿瘤药物递送载体。二氢硫辛酸(DHLA)是一种由硫辛酸加氢还原 而成的有机化合物,是带有两个巯基的羧酸[7],它存在两种对映异构体,但只有其中的 R-型对映体具有生物学活性〔&9〕,二氢硫辛酸的结构如图2-l(b)所示。实验使用的DL-硫 辛酸即为a-硫辛酸结构如图2-1(a)所示。DL-硫辛酸是一种独特的抗自由基物质[10],通 常被称为广泛抗氧化剂:11],,由于巯基与量子点表面金属元素如Cd, Zn之间有很强的配 位能力[12],一般作为配位剂进行置换[13],但单巯基配体包覆的量子点一般稳定性较差
[14]。通过使用含有双巯基的二氢硫辛酸,能使量子点在水溶液中稳定性提高[15,16]。
 
S-S SHHS
 
(a)LA:硫辛酸 ⑹DHLA:二氢硫辛酸
图2-1 (a)硫辛酸的结构式和(b)二氢硫辛酸的结构式
聚乙二醇不仅能加强纳米载药体系的水溶性和稳定性[17],还能使纳米载药体系尽 可能避免被网状内皮组织系统识别和非特异性摄取[18],从而延长该载药体系在循环中 的半衰期。因此,我们在经过二氢硫辛酸水溶性修饰后的量子上连接上了 PEG2000。
选用10-羟基喜树碱(HCPT)作为该体系所载的抗癌药物,10-羟基喜树碱是从珙桐科 植物喜树中分离出来的喹啉类生物碱「⑼,结构如图2-2所示。它是S期的特异性抗癌药 物,作用机制为抑制DNA拓扑异构酶I。0,2巴毒性比喜树碱小,与常用抗癌药物无明 显交叉耐药性:22]o然而,由于其水溶性差以及在生理pH条件下打开不稳定内酯环而导 
致的内在不稳定性,使得HCPT在临床上无法得到有效的应用[23],而纳米药物载体的存 在完美的解决了这个问题。
 
O OH
 
图2-2 HCPT结构式
在该研究体系中我们通过带有双巯基的二氢硫辛酸修饰量子点增加其水溶性,再连 接聚乙二醇(PEG)使其具有良好的生物相容性,以及延长整个体系的体内循环时间, 最后负载上抗癌药物HCPT,设计构筑具有抗肿瘤活性的纳米药物递送体系。细胞实验 结果表明该纳米载药体系能够诱导细胞凋亡和增强自噬来抑制癌细胞的增殖,动物实验 结果表明,该载药体系CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT对小鼠4T1肿瘤模型具有良好的 治疗效果,且对小鼠的器官毒性较小,是一种有发展潜力的纳米载药体系。
24
2.2实验部分
2.2.1主要试剂
表 2-1 实验所需主要试剂
名称 厂家
氧化镉(CdO) 硒粉(Se) 油酸(OA) 硬脂酸 丁二酸酹 聚乙二醇(PEG, M.W.2000) 均购自上海阿拉丁生化试剂公司
硫粉(S)
氧化锌(ZnO) 十八胺(ODA) 十八烯(ODE) 二环己基碳二亚胺(DCC) 4-二甲氨基毗呢(DMAP) 10男基喜树碱(HCPT) 均购自上海柏卡化学技术有限公司
三正辛基氧化麟(TOPO) 三正辛基麟(TOP) 均购自美国Alfa Aesar
碳酸氢钠(NaHCOs) 氯化钠(NaCl) 十二水磷酸氢二钠(Na2HPO4l 2H2O) 氯化钾(KC1) 磷酸二氢钾(KH2PO4) 均购自天津科密欧化学试剂公司
DAPI
Hoechst33342
线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1) II塞哇蓝(MTT) 二氢乙锭(DHE) 均购自北京索莱宝科技有限公司
单丹磺酰尸胺(MDC) 细胞凋亡试剂盒 胰蛋白酶 青链簿素混合液(100x) 均购自北京索莱宝科技有限公司
胎牛血清 购自浙江天杭生物科技股份有限公司
实验用细胞 购门屮科院上海细胞库
 
2.2.2主要仪器
表 2-2 实验所需仪器
仪器 型号 厂家
紫外可见近红外光谱仪 UV 3600 Plus 日本岛津
荧光分光光度计 CARY ECLIPSE 美国安捷伦
徕卡激光共聚焦显微镜 LEICA TCS SP8+STED 德国徕卡
流式细胞仪 BD Facsverse 美国 BD
多功能微孔板读板机 CLARIOstar 德国 BMG
200KV 场发射透射电镜 JEOL JEM-F200 日本电子株式会社
激光粒度及 zeta 电位分 析仪 NanoZS90 英国马尔文公司
小动物活体成像系统 IVIS Lumina XRMS Series III 美国 PerkinElmer
 
2.2.3主要溶液的配制
DMEM培养基的配制:将袋装DMEM粉末转移到1000 mL烧杯中,加入800 mL 三蒸水,搅拌溶解后,称取2.00 g的NaHCO3倒入烧杯中,然后加入10 mL的青链霉素 混合液,混合均匀后,定容至1000 mL。然后用灭菌过并装有0.22 pm、0.45 pm滤膜的 滤器在超净台内过滤培养基,过滤后的培养基分装并做好标记密封置于4 °C冰箱备用。 使用前需加入适量胎牛血清,配制成含有10 %胎牛血清的培养基。
PBS 缓冲溶液的配制:称取&00 g 的 NaCl、0.20 g KC1、3.63 g 的 Na2HPO4.12H2。、 0.24 g KH2PO4置于1000 mL烧杯中,然后用三蒸水定容至1000 mL,用装有0.22 pm、 0.45 pm滤膜并且灭菌后的滤器过滤,过滤后的PBS缓冲溶液分装标记密封保存于4 C 冰箱。
胰蛋白酶的配制:准确称取0.63 g EDTA粉末转移至1000 mL烧杯中,加入900 mL PBS缓冲溶液后快速搅拌,在EDTA完全溶解后,加入1.25 g胰蛋白酶并定容至1000 mL,缓慢搅拌24 h,之后加入适量NaOH固体颗粒将溶液pH调至&0。之后在超净台 内使用装有0.22 pm、0.45 pm滤膜并且高温灭菌过的滤器过滤胰蛋白酶液体,过滤后的 胰蛋白酶分装标记并密封置于4 C冰箱保存。
MTT的配制:将准确称量的0.10 g MTT粉末转移至250 mL的烧杯中,加入100 mL的PBS缓冲溶液,避光搅拌4 h,待其完全溶解后,使用装有0.22 pm滤膜的滤头 避光过滤,过滤得到的MTT液体标记密封避光保存于4 C冰箱。
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4 % 多聚甲醛溶液的配制:将准确称量的 40.00 g 多聚甲醛粉末倒入 1000 mL 的烧 杯中,然后加入PBS缓冲溶液定容至1000 mL, 50 °C恒温水浴搅拌4 h,待其完全溶解 后,分装后密封并做好标记置于4 C冰箱保存。
2.2.4CdSe/ZnS 量子点的合成及修饰
用有机金属方法合成了三辛基氧化膦(TOPO)包裹的CdSe/ZnS量子点。
(1)量子点合成所需前驱体的制备
1 M Se前驱体的制备:将称取的1.52 g硒粉转移至50 mL的圆底烧瓶中,再向其 中加入移液枪精确量取的19 mL TOP,之后玻璃塞密封圆底烧瓶,于室温搅拌至澄清透 明,再将该前驱体转移到带有标记的玻璃瓶中,最后密封保存在干燥器中。
0.04 M S前驱体的制备:用万分之一天平准确称取0.03 g S粉,转移至连接有氮气 球以及冷凝回流装置的50 mL三颈瓶内,再向其中加入移液枪精确量取的20 mL ODE, 接着,对装置进行密封以及抽真空操作,保证装置内的无水无氧条件,加热至200 C得 到淡黄色的澄清透明溶液,待该溶液冷却至室温后,拆除装置,并将合成的该前驱体转 移至带有标记的玻璃瓶中,最后密封保存在干燥器中。
0.04 M ZnO前驱体的制备:用万分之一天平准确称取0.06 g ZnO粉末,转移至连 接有氮气球以及冷凝回流装置的 50 mL 三颈瓶内,接着向其中加入移液枪精确量取的 14.40 mL ODE和5.60 mL的OA,同样的,对该装置进行密封以及抽真空操作,保证装 置内的无水无氧条件,加热至310°C得到淡黄色的澄清透明溶液,待该溶液冷却,拆除 装置,并将合成的该前驱体转移至带有标记的玻璃瓶中,最后密封保存在干燥器中。
(2)CdSe/ZnS 的合成
将准确称取的 0.03 g CdO 粉末和 0.23 g 硬脂酸转移至连接有氮气球以及冷凝回流 装置的50 mL三颈瓶内,再向瓶中加入移液枪量取的2.60 mL ODE,接着,对装置进行 密封,并在整个装置抽真空十分钟后向其中通入氮气,在无水无氧以及氮气保护条件下, 缓慢升高加热装置温度直至200 C,得到澄清透明的溶液。待冷却至室温,向其中快速 加入准确称量的1.50 g的ODA和0.50 g的TOPO后,及时密封装置并抽真空十分钟, 之后通入氮气。同样的,在无水无氧以及氮气保护条件下,加热至280 C,立即用注射 器加入2.00 mL 1 M Se前驱体溶液,并降低装置温度到250 C,并保持此温度反应0.5 h,得到CdSe量子点溶液。
待以上反应完成后,降低装置温度至240 C,接下来进行对CdSe量子点外层包裹 ZnS壳层的操作。首先,向装置中同时快速注入各为0.49 mL的ZnO前驱体和S前驱 体,并保持240 C反应20 min,形成第一层ZnS壳层。接着,再向装置中同时快速注入 各为0.65 mL的ZnO前驱体和S前驱体,并保持240 C反应20 min,形成第二层ZnS 壳层。最后,向装置中同时快速注入各为0.85 mL的ZnO前驱体和S前驱体,并保持 240 C反应20 min,形成第二层ZnS壳层。待反应到时间后,停止加热并继续搅拌冷却 至室温。
接下来,将冷却至室温的 CdSe/ZnS 量子点进行纯化处理。首先,向三颈瓶中加入 20 mL 的正己烷,稀释量子点并转移至 250 mL 的分液漏斗中,再向其中加入适量的 CH3OH,之后封上分液漏斗的玻璃塞,剧烈震荡后,静置待液体分层,此时,我们可以 观察到液体上层为橘黄色的量子点与正己烷的混合液,下层为甲醇液体等,弃去下层液 体。重复三次以上操作,从而得到纯净的量子点与正己烷的混合液。加入丙酮,沉淀混 合液中的量子点,8000 rpm离心10 min后,收集沉淀在离心管底部的量子点,并适量 用CHC13溶解后,密封标记保存在4 C冰箱备用。
(3)cHCPT 的合成
cHCPT的合成参考Wu等人的方法[24],合成路线如图2-3所示,准确称取0.04 g 丁 二酸酐于25 mL圆底烧瓶中,向其中加入5 mL无水二甲基甲酰胺(DMF)进行搅拌溶 解,再向其中加入0.04 g的4-二甲基吡啶(DMAP)继续搅拌半个小时,进行酸酐的开环 及羧基活化,之后加入0.10 g的10-羟基喜树碱(HCPT),室温搅拌24 ho之后加入0.50 mL的20%甲醇水溶液继续搅拌30 min,以水解过量酸酐。
 
 
图 2-3 cHCPT 的合成路线
得到的黄色液体加入15 mL甲醇后在4 C下静置过夜,待其析出结晶,收集产物真 空干燥,并进行柱层析纯化,得到的纯化物进行核磁分析。结果如图 A-1, B-1, C-1 所 示:扫 NMR (300 MHz, DMSO-d6) 6 &44 (s, 1H), &02 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 7.44 (dd, J = 9.2,
2.7Hz, 1H), 7.29 (d, J = 2.7 Hz, 1H), 7.02 (s, 1H), 5.46 (s, 2H), 5.23 (s, 2H), 2.78 (d, 2H), 2.44
28
(d, J = 6.7 Hz, 2H), 2.14 (q, J = 7.4 Hz, 2H), 0.91 (t, J = 7.4 Hz, 3H). 13C NMR (75 MHz,
DMSO-d6) 6 171.47, 167.33, 156.93, 156.61, 149.12, 146.36, 145.41, 143.16, 130.54, 129.80,
129.74, 129.24, 123.21, 117.98, 108.84, 106.74, 94.25, 75.90, 66.33, 50.11, 38.83, 30.42, 28.91, 7.58. ESI-MS (m/z): 463.01 for [M-H]-.
(4)DHLA 的合成
DHLA的合成参考崔等实验方法[24],如图2-4所示,先称取0.16 g的DL-硫辛酸 (LA)粉末转移至100 mL圆底烧瓶中,再向其中加入20 mL甲醇,搅拌溶解后,得到淡 黄色的澄清透明液体。然后,在准确称取0.06 g的NaBH4,少量缓慢加入瓶中,室温搅 拌2 h后,停止搅拌。由于该反应产率较高,达到90 %以上,且仅有产物二氢硫辛酸带
有双巯基可修饰于量子点之上,原料药DL-硫辛酸(LA),及溶剂甲醇对后续反应无影响, 且易除去,故此处可不进行相关的分离提纯,直接进行下一步反应。
 
图 2-4 DHLA 的合成路线
 
2.2.5合成 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系
CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 的合成路线如图 2-5 所示:向上一步合成的二氢硫辛 酸液体中加入适量合成的CdSe/ZnS量子点氯仿混合液,避光搅拌3 h,我们可以观察到 量子点转移至上层,并且量子点的颜色由原来的橘黄色转变成红色,下层为无色氯仿层。
我们将上层修饰后的量子点转移至7 mL EP管中,水溶性量子点和丙酮按照1:2的 体积比混合,晃动均匀,然后在10000 rpm条件下离心5 min,弃去上清液,收集沉淀, 即得纯净的水溶性量子点CdSe/ZnS@DHLA固体。
将上一步合成的CdSe/ZnS@DHLA溶于15 mL二甲基亚砜(DMSO)中,再向其 中加入0.37 g二环己基碳二亚胺(DCC)和0.03 g 4-二甲氨基吡啶(DMAP),搅拌半小时溶 解后,加入6.00 g的PEG2000,室温避光搅拌12 h。得到的产物转移至7 mL EP管中, 产物和丙酮按照1:2的体积比混合,晃动均匀,在12000 rpm条件下离心10 min,弃去 上层液体,得纯净的 CdSe/ZnS@DHLA-PEG。
取合成的0.10 g cHCPT用15 mL无水二甲基亚砜溶解后,再用0.02 g DCC和0.04
g DMAP活化羧基30 min后,按照药物与载体重量比1:1投放载体,即加入合成的0.10 g CdSe/ZnS@DHLA-PEG,室温避光搅拌 12 h。
同样的是,将得到的产物转移至7 mL EP管中,产物和丙酮按照1:2的体积混合, 晃动均匀,在10000 rpm条件下离心15 min,得纯净的CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT, 接下来将收集的产物进行冷冻干燥,并称重,离心得到的上清液同样收集起来,以便后 续进行载药量的检测。
 
CdSe/ZnS CdSe/ZnS@DHLA CdSe/ZnS@DHLA-PEG CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT
 
=DHLA "X. =PEG2000 . fHCPT
图 2-5 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 的合成路线示意图
2.2.6CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系的表征
(1)CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系的粒径
用动态光散射(DSL)法进行测定。在皿中加入3 mL过滤后的纳米粒子水溶液,用 Malvern 激光粒度及 Zeta 电位分析仪进行检测。
(2)CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系的电荷
在马尔文比色皿中加入1 mL过滤后的纳米粒子水溶液,用Malvern激光粒度及Zeta 电位分析仪进行检测。
(3)CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系的形态
将少量液态样品滴到铜网上,做好标记后进行真空烘干,用200 KV场发射透射电 镜进行形态检测。
2.2.7CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系体外性质研究
(1) CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系载药量和包封率的测定
以二甲基亚砜(DMSO)为溶剂,配制浓度分别为10 pg/mL、20 pg/mL、50 pg/mL、
100 pg/mL、150 pg/mL的HCPT溶液,测定各溶液的紫外-可见光谱,选取250~450 nm
30
波段谱图。根据图谱信息,我们选择合适的吸收峰处的吸光度值绘制HCPT的浓度与吸 光度值的标准曲线。根据该标准曲线我们可以得出合成CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT载 药体系中最后一步中上清液中所含HCPT的量m1,由于投入HCPT参与反应的量m2是 已知的,故负载上的HCPT的质量m3为:
m3(g)=m2-m1 (式 2-1)
投入反应前载体CdSe/ZnS@DHLA-PEG的质量为m4,最后合成体系
CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT的最终质量为m5,则该载药体系的载药量计算公式为:
Drug loading(%)=m3/m5x100% (式 2-2)
该载药体系的包封率计算公式为:
Encapsulation efficiency(%) =m3/m2x100% (式 2-3)
(2) CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系体外释放模拟实验
采用动态膜透析法检测CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT载药体系的HCPT体外释放 情况。其中释放介质分别为pH5.5(肿瘤酸性微环境)和pH7.4(正常组织pH条件)的PBS 缓冲溶液。将含有 1.00 mg HCPT 的 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 溶于 1 mL PBS 缓冲 溶液中,然后,转移至已经预处理过的透析袋中(1000 Da) ,两端扎紧后置于装有20 mL 释放介质的50 mL锥形瓶中,共两组,每组设置三个平行实验,均放置于恒温水浴摇床 (37 C, 100 rpm)中震荡。分别于固定时间点 0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、
12 h、24 h、48 h、72 h取出2 mL释放介质,然后向对应锥形瓶中补充2 mL相应的释 放介质。取出的释放介质用紫外检测其中HCPT的含量,然后以释放时间为横坐标,以 累积释放百分率为纵坐标绘制药物释放曲线。
计算公式: 药物累积释放量=CnxV+Ei=11(Ci xv) (式2-4)
药物累积释放率=药物累积释放量/药物总量x100% (式2-5)
相关符号说明:药物释放取样点有1、2、3、个时间点,Cn为第n个时间点 的释放药物浓度,V为透析的释放介质总体积,Ci为第n个点之前的任意一点的药物浓 度,v为取出的释放介质体积。
2.2.8细胞的培养
复苏实验所需的各种细胞:将冻存管中的细胞于37 C恒温水浴融化后,快速放入
离心机中以1000 rpm的转速离心5 min。离心完成后,在超净操作台小心倒掉上清液, 再加入1 mL新鲜培养基进行重悬,重悬液接种到含有3 mL 10 %胎牛血清的新鲜培养 基的培养皿中,将重悬液与培养基混合均匀后,对培养皿进行标记,静置五分钟待细胞 沉降至培养皿底部且均匀分散后,将该培养皿放入37 °C、5 % CO2培养箱中培养。
细胞的换液与传代:通常细胞的换液与传代是隔天进行的。当显微镜下观察到培养 皿中的细胞数量较少时,我们选择换液,即在超净操作台中,用移液枪将培养皿中的培 养基吸走弃去,然后再向培养皿中加入3 mL 10 %胎牛血清的新鲜培养基,之后,将换 过液的培养皿放入37 C、5 % CO2培养箱中培养。通常在换液后的第二天,此时培养皿 中的细胞生长较为快速,当细胞生长分布密度为培养皿底部的 80 %左右时,此时即可进 行细胞的传代操作。即先在超净操作台中,用移液枪吸去皿中的培养基,然后向培养皿 中加入1 mL胰蛋白酶,在显微镜下观察培养皿中的细胞形态变化,待细胞之间出现间 隙时,迅速吸去胰蛋白酶,并加入1 mL新鲜培养基吹掉培养皿底部的细胞,将细胞混 悬液转移至1.5 mL的离心管中以1000 rpm的转速离心5 min。离心结束后,在超净操 作台小心倒掉上离心管中的上清液,再加入1mL新鲜培养基进行重悬,取适量重悬液 接种到含有2 mL新鲜培养基的培养皿中,将重悬液与培养基混合均匀后,对培养皿进 行标记,静置五分钟待细胞沉降至培养皿底部且均匀分散后,将该培养皿放入37 °C、 5 % CO2培养箱中培养。
2.2.9细胞毒性检测
取HeLa (人宫颈癌细胞),HL-7702 (人正常肝细胞),A549 (人肺癌细胞),SH- SY5Y (人胶质瘤细胞),HepG2 (人肝癌细胞),MDA-MB-231 (人乳腺癌细胞)生长对 数期细胞接种到96孔板中,每孔90pL、7x103个细胞,培养24 h后,将纳米载药体系 配成 20 pg/mL、50 pg/mL、100 pg/mL、200 pg/mL、500 pg/mL 这 5 个浓度,加药体积 为10 pL,每个药物浓度做3个平行对照。加药48 h后,每孔各加入50 pL MTT,在培 养箱中作用4 h,然后弃去孔中液体,再向每个孔各加入100 pL二甲基亚砜溶解蓝紫色 结晶,用酶标仪测定570 nm处的吸光度。计算CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT载药体系 对细胞的IC50值(半数致死药物浓度)。
Cell Viability(%)=(ODn-ODb)/(ODa-ODb) x100% (式 2-6)
符号说明:ODn为样品的吸光值;ODb为MTT溶液背景吸光值;ODa为阴性对照
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组的吸光度值。
2.2.10细胞成像
将处于对数生长期的HeLa细胞,接种于激光共聚焦培养皿内,置于37 °C恒温细胞 培养箱中培养一定时间后,待细胞生长至合适的密度,吸去原有的培养基,加入配制的 500 yL 含有浓度分别为 7 yg/mL、14 yg/mL、21 yg/mL 的 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系的新鲜培养基,于细胞培养箱孵育6 h后,吸去激光共聚焦培养皿中的培养基。 用PBS缓冲液小心冲洗细胞后,加入500 yL浓度为1 yg/mL的细胞核染料DAPI、37 C 避光染色10 min后弃去染液,再用PBS缓冲溶液冲洗细胞,最后加入500 yL新鲜培养 基,然后用激光共聚焦显微镜观察细胞对 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 的摄取情况, 细胞核染料用 405 nm 激发光波长激发,纳米载药体系用 488 nm 激发。
2.2.11对细胞凋亡的影响
将处于对数生长期的HeLa细胞,以合适密度接种于六孔板中,置于37 C、5 % CO2 的培养箱中培养一天,待细胞生长至合适的密度后,吸去培养基,然后向其中三个孔加 2 mL 的含有浓度分别为 7 yg/mL、14 yg/mL、21 yg/mL CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 的培养基, 2 mL 的含有浓度为 21 yg/mL HCPT 的培养基,以及 2 mL 含有浓度为 21 yg/mL CdSe/ZnS@DHLA-PEG的培养基,并做好标记,继续于细胞培养箱中培养48 h, 收集六孔板内所有的细胞于离心管中并标记,以2000 rpm离心10min后,然后用Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒染色,使用流式细胞仪检测荧光强度。
2.2.12对细胞自噬的影响
将处于对数生长期的HeLa细胞,以合适密度接种于六孔板中,置于37 C、5 % CO2 的培养箱中培养一天,待细胞生长至合适的密度后,吸去培养基,其中三个孔中加入2 mL 的含有浓度为 7 yg/mL、14 yg/mL、21 yg/mL CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 的培养 基,一个孔加入2 mL的含有浓度为21 yg/mL HCPT的培养基,一个孔加入2 mL含有 浓度为21 yg/mL CdSe/ZnS@DHLA-PEG的培养基,最后一个孔加入2 mL新鲜培养基, 做好标记后,于细胞培养箱中培养48 h,收集六孔板内所有的细胞及液体于离心管中并 标记,以2000 rpm离心10min后,每个离心管加入500 yL的MDC工作液,与细胞共
同作用1 h,染色完成后,对细胞进行离心并洗涤,用500 pL的PBS重悬,用筛网过滤 后,用流式细胞仪进行检测。细胞自噬检测试剂盒中的MDC自噬体染色探针为绿色荧 光标记的自噬体探针,具有335 nm/518 nm的最大激发/发射波长。
2.2.13对细胞线粒体膜电位的影响
将处于对数生长期的HeLa细胞,以合适密度接种于六孔板中,置于37 C、5 % CO2 的培养箱中培养一天,待细胞生长至合适的密度后,吸去培养基,其中三个孔中加入2 mL 的含有浓度为 7 pg/mL、14 pg/mL、21 pg/mL CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 的培养 基,一个孔中加入2 mL的含有浓度为21 pg/mL HCPT的培养基,一个孔中加入2 mL 含有浓度为21 pg/mL CdSe/ZnS@DHLA-PEG的培养基,并做好标记,继续于细胞培养 箱中培养48 h,收集六孔板内所有的细胞于离心管中并标记,然后用JC-1试剂盒处理 细胞,流式细胞仪检测荧光强度。
2.2.14对细胞中活性氧含量的影响
将处于对数生长期的HeLa细胞,以合适密度接种于六孔板中,置于37 C、5 % CO2 的培养箱中培养一天,待细胞生长至合适的密度后,吸去培养基,然后其中三个孔加入 2 mL 的含有浓度分别为 7 pg/mL、14 pg/mL、21 pg/mL CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 的培养基, 2 mL 的含有浓度为 21 pg/mL HCPT 的培养基,以及 2 mL 含有浓度为 21 pg/mL CdSe/ZnS@DHLA-PEG的培养基,最后一个孔加入2 mL新鲜培养基,做好标记 后,于细胞培养箱中培养48 h,收集六孔板内所有的细胞及液体于离心管中并标记,然 后用活性氧检测试剂盒(DHE)处理细胞。DHE荧光探针激发波长510 nm,发射波长610 nm附近,使用流式细胞仪检测DHE产物荧光,从而测定组织内活性氧水平。
2.2.15生物体内分布
选用六周龄左右的BALB/C雌性小鼠,将处在对数生长期的4T1细胞以1X107 / 只的量注射到小鼠右前肢腋下,注射体积为100 pL,建立皮下肿瘤模型。接种完成后, 待肿瘤生长100 mm3左右进行活体成像实验。
选取七只接瘤小鼠并随机进行标记区分,均按 5 mg/kg CdSe/ZnS@DHLA-PEG- HCPT的剂量尾静脉注射给药,给药体积是200 pL,七只小鼠的给药后作用时间分别是
34
1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h,到相应的时间后处死小鼠,解剖取心,肝,脾, 肺,肾,肿瘤用于小动物活体成像仪拍摄。分析该载药体系在小鼠体内各个脏器及肿瘤 中的分布随时间的变化情况。
2.2.16对肿瘤的抑制效果
选用六周龄左右BALB/c雌性小鼠,将处在对数生长期的4T1细胞以1X107只的 量注射到小鼠右前肢腋下,注射体积为100 pL,建立皮下肿瘤模型。接种完成后,待肿 瘤生长100 mm3左右将小鼠随机分为三组,分别是生理盐水组,CdSe/ZnS@DHLA-PEG- HCPT 组, HCPT 组,每组 10 只小鼠并进行标记。三组小鼠分别尾静脉注射给药,给 药体积均是200 yL,其中生理盐水组,注射的是生理盐水,HCPT组给的HCPT(5 mg/kg), CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 组给的是 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT (5 mg/kg)。隔天 给药,共给药 7 次,给药时测量各组小鼠体重和肿瘤体积并记录。
小鼠的肿瘤体积计算公式为:
V=W2XL/2 (式 2-7)
符号说明:V代表肿瘤体积,W代表肿瘤短径,L代表肿瘤长径 第十五天处死小鼠,解剖小鼠,称量肿瘤,心,肝,脾,肺,肾的重量,然后均储 存于多聚甲醛中。肿瘤和脏器均由塞维尔生物科技有限公司进行H&E染色。
2.3结果和讨论
2.3.1紫外荧光及红外表征结果
我们对合成的 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系进行了紫外和荧光检测,检 测结果如图2-6所示。图(a)是CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT载药体系的荧光图谱,由 图可见水溶性修饰后的量子点荧光荧光峰出现了偏移且荧光强度有所下降,证明量子点 的成功修饰,负载阳性药 HCPT 后荧光峰也同样出现了蓝移,证明药物的成功负载。
图(b)是CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT载药体系的紫外图谱,我们可以看到图中量 子点的特征吸收峰在488 nm和588 nm处,且连接了 HCPT后在400 nm~450 nm处出 现了新的吸收峰,证明该载药体系的成功合成。
 
图2-6 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT载药体系的荧光图谱(a)和紫外图谱(b) 接下来,我们对 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 纳米载药体系进行了红外表征,结 果如图 2-7 所示。图中的 a, b, c 分别代表 CdSe/ZnS@DHLA, CdSe/ZnS@DHLA-PEG, CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT。其中 2590 cm-1 处为-SH 的红外吸收峰,1708 cm-1, 122 7cm-1处为-COOH的红外吸收峰。由此可知,图a中,DHLA成功修饰到CdSe/ZnS量 子点上。1055 cm-1处为酯基的吸收峰,700 cm-1处为长链饱和烷烃的吸收峰,因此b图 的红外图谱表明PEG2000成功通过酯键链接到DHLA修饰的量子点上。图c中出现了- SH,酯键,PEG2000长链烷烃的吸收峰,而且出现了峰型,峰位置,峰强度的变化,说 明合成了新的化合物 CdSe/ZnS@DHLA-PEG2000-HCPT。
 
图 2-7 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系的红外图谱;a: CdSe/ZnS@DHLA, b:
CdSe/ZnS@DHLA-PEG, c: CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT
2.3.2透射电镜检测结果
透射电镜对 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 纳米载药体系的形貌检测结果如图 2-8
36 
所示,CdSe/ZnS量子点的粒径大都分布在4.20 nm,转水后的CdSe/ZnS@DHLA-PEG量 子点粒径大概在4.70 nm,而负载了 cHCPT之后,粒径有所增大,大约为5.50 nm,由 粒径的变化我们可以推断出该载药体系的成功合成。观察透射电镜图我们可以发现,合 成的量子点呈球形且均匀分散,而且转换成水溶性量子点以及载药后没有发生聚集现象。
(a) CdSe/ZnS (b) CdSe/ZnS@DHLA-PEG (c) CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT
 
图 2-8 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系的透射电镜图
 
2.3.3Zeta 电位检测结果
纳米粒子的表面电荷的变化能从侧面反映出药物连接的成功与否,因此,我们进行 了相关检测,检测结果如图2-9所示。从图中我们可以看到CdSe/ZnS@DHLA电位值为 -21.80 mV,带负电荷,这是由于量子点表面分布着二氢硫辛酸的羧酸官能团。连接PEG 后,其电位变大,这是由于聚乙二醇的包覆作用,使整体电负性下降。连接cHCPT后, 电位又降低到-12.10 mV, 这是由于连接的 HCPT 带有羧基官能团。 结果表明 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 连接成功。
 
 
-30
 
 
图 2-9 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系的 Zeta 电位图
2.3.4药物释放结果
为了检测纳米载药体系的药物释放情况,我们对 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载 
药体系进行了体外模拟试验。图2-10为CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT在pH 5.5和pH
7.4 条件下的药物释放图像。由该实验结果我们可以看出,在同样的时间间隔条件下,
CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT在pH 5.5条件下的HCPT释放量明显高于pH 7.4条件下 的释放量,而且药物的释放总量也较高。其中pH 5.5代表肿瘤酸性微环境,而pH 7.4代 表正常组织微环境,由此我们可以看出,CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT纳米载药体系能 够在肿瘤微环境下实现高效释药,提高药物的作用疗效。
 
 
图 2-10 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系的药物释放图像
2.3.5载药率和包封率检测结果
载药率是指药物负载量与纳米载药体系总量之比,它能很好地评价纳米载体对药物 的负载情况,给药量相同的情况下,药物的负载率越高,纳米载药体系就能运输更多的 药物进入作用部位发挥药效。而包封率是药物负载量与投入药物量之比,它能帮助我们 确定合成过程中的最佳投料比。
因此,我们检测了质量浓度分别为10 yg/mL、 20 yg/mL、 50 yg/mL、 100 yg/mL、 150 yg/mL的HCPT的紫外吸收,并选取这五个浓度的最大紫外吸收波长处的吸光度值, 来做 HCPT 浓度与紫外吸光度值的标准曲线,以便进行载药率和包封率的计算,结果如 图2-11所示。其中(a)图为质量浓度分别为10 yg/mL、20 yg/mL、50 yg/mL、100 yg/mL、 150 yg/mL的HCPT-COOH的紫外吸收曲线;(b)图为HCPT的浓度与吸光度值的标准 曲线。由图(a)可知HCPT在388 nm处的紫外吸收最大,然后选取这五个浓度在此波长 处对应的吸光度值,做标准曲线图,得到y=0.0265x+0.0637 (R2=0.9978),即为HCPT的 紫外吸光度值与浓度的关系公式。
38
 
图2-11 (a)为不同浓度HCPT的紫外吸收图;(b)为HCPT的标准曲线图
 
为了探寻投料比对 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系的载药率和包封率的影
响,以确定最佳的投料比,优化合成条件,我们设计了三种不同的载体和药物的质量投 放比进行检测。
由表2-3的检测结果可知随着载体CdSe/ZnS-DHLA-PEG与阳性药HCPT的质量比 增加, CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 体系的载药率逐渐增加,包封率逐渐降低,这可能 是因为当投药量增大时,载体上没有足够化学键结合过量的药物HCPT,从而导致包封 率下降。由于当投料比为 1:1 和 1:2 的载药量相差不大,我们选择按照1:1 的投料比进 行后续试验。
表2-3 CdSe亿nS@DHLA-PEG-HCPT载药体系的载药率和包封率
CdSe/ZnS-DHLA- PEG:HCPT (m/m) 包封率 载药率
1:0.5 79.50 % 11.32%
1:1 75.21 % 17.61%
1:2 70.73 % 20.65 %
 
2.3.6MTT 检测结果
我们选用MTT法检测CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT载药体系对HeLa (人宫颈癌 细胞),HL-7702 (人正常肝细胞),A549 (人肺癌细胞),SH-SY5Y (人胶质瘤细胞), HepG2 (人肝癌细胞),MDA-MB-231 (人乳腺癌细胞)的毒性,以确定其抗癌效果,得 到的实验结果如表2-4所示。
由表中结果可知,载体 CdSe/ZnS@DHLA-PEG 对细胞的 IC50 值均在 500 pg/mL 以 上,说明该载体对细胞的毒性很小,是良好的药物载体。而载药后的 CdSe/ZnS@DHLA- PEG-HCPT表现出了较好的抑制肿瘤效果,其中该载药体系对HeLa的抑制效果最好,
其 IC50 值在 7.61 yg/mL 左右。 同时, 我们可以看出, 相比于阳性药 HCPT, CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT载药体系对正常细胞HL-7702的IC50值较大,说明该载 药体系对正常细胞的毒性较小。
表 2-4 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系对不同细胞的 IC50 值
IC50(pg/mL)
Drug HeLa SH- MDA-
MB-231 HL-
7702
A549 SY5Y HepG2
CdSe/ZnS@DHLA-
PEG >500 >500 >500 >500 >500 >500
CdSe/ZnS@DHLA- 7.61± 14.40± 17.94 ± 27.88± 25.67± 43.68±
PEG-HCPT 0.51 0.34 1.32 2.62 2.04 1.42
HCPT 10.44 ± 18.83± 20.34± 31.15± 28.90± 36.25±
2.20 1.75 0.91 1.53 0.73 2.67
 
2.3.7细胞成像结果
量子点具有荧光,因此纳米载药体系 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 进入细胞的情 况可通过激光共聚焦进行检测。图 2-12 为 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 和阳性药 HCPT作用于HeLa细胞6 h的细胞成像结果。由结果可知CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 进入细胞的量与药物浓度有关,浓度越大,荧光越强,进入细胞中的药物量越多。而且 图像显示相同浓度下的 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 进入 HeLa 细胞中的量多于阳性 药HCPT,这说明该纳米载药体系具有良好的药物递送效果。
 
 
图2-12 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT和阳性药HCPT与HeLa细胞共孵育6 h后的激光共聚焦图片
40
2.3.8细胞凋亡检测结果
细胞凋亡(apoptosis)是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程,所以也常常 被称为程序化细胞死亡(programmed cell death, PCD)。由图2-13的流式细胞仪检测结 果我们可以看出,随着药物CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT浓度的增大,细胞凋亡增多。 而且载药体系 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 与阳性药 HCPT 相比,具有更好的诱导细 胞凋亡的效果。
 
 
 
RTC-A HTC-A FTTC-A
Q-DHLA-PEG-HCPT Q-DHLA-PEG-HCPT Q-DHLA-PEG-HCPT
7 |lg/mL 14 |lg/mL 21 p.g/mL
 
图 2-13 流式细胞仪检测 CdSe/ZnS@DHLA-PEG、CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 以及 HCPT 与
HeLa细胞共孵育48 h后对细胞凋亡的影响(Annexin V-FITC/PI染色)
2.3.9细胞自噬检测结果
单丹磺酰尸胺(MDC)是一种嗜酸性染色剂,用于标记自噬体的形成,其荧光强度与 自噬体的数量成正比。流式数据结果:纳米载药体系作用细胞后,细胞内的荧光明显增 强(图2-14),说明我们的纳米载药体系CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT能够显著的诱导肿 瘤细胞发生自噬,且较阳性药HCPT具有更好的效果。
 
 
图 2-14 流式细胞仪检测 CdSe/ZnS@DHLA-PEG、CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 以及 HCPT 与
HeLa细胞共孵育48 h后对细胞自噬的影响(MDC染色)
2.3.10细胞线粒体膜电位检测结果
我们利用 JC-1 检测细胞线粒体膜电位变化,在线粒体膜电位较高时, JC-1 因聚集 在线粒体的基质中而产生红色荧光,反之,线粒体膜电位较低时 JC-1 不能聚集而表现 为单体形态,产生了绿色荧光,常用红绿荧光的相对比值来衡量线粒体去极化的比例。
由实验结果图2-15可知,CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT药物浓度增加,检测得到 的红绿荧光比值降低,说明线粒体膜电位在不断下降。而线粒体膜电位的下降是细胞凋 亡早期的一个标志性事件,因此该检测结果说明药物 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 通 过降低线粒体膜电位,从而诱导细胞发生凋亡。
Control CdSe/ZnS@DHLA-PEG HCPT CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 2i(pg/mL) 21(ng/mL) 7(|ig/mL) 14(pg/mL) 21(pg/mL)
 
 
图 2-15 流式细胞仪检测 CdSe/ZnS@DHLA-PEG、CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 以及 HCPT 与
HeLa细胞共孵育48 h后,对细胞线粒体膜电位的影响(JC-1染色)
42
2.3.11细胞中活性氧含量检测结果
由实验结果图2-16可知,CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT药物浓度增加导致细胞中 的活性氧含量变低。细胞内活性氧含量的升高可以促进细胞凋亡,而实验结果与此相反, 这可能是因为载体材料中的二氢硫辛酸为活性氧清除剂,当药物浓度增加时,二氢硫辛 酸的含量也增加,故导致细胞内的活性氧含量减少。
 
图 2-16 流式细胞仪检测 CdSe/ZnS@DHLA-PEG、CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 以及 HCPT 与
 
HeLa细胞共孵育48 h后,对细胞活性氧含量的影响(DHE染色)
2.3.12体内分布情况检测结果
由于纳米粒子的粒径大小,电性等性质均会影响其在生物体内的分布和循环时间, 因此我们用 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系进行实验,分别在小鼠尾静脉给药 后的2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h时间点进行解剖取出脏器进行拍照,结果如图2-17 所示。由图中我们可以看出,随着时间的推移,肿瘤中的荧光强度含量呈现先增强后变 弱的趋势,而且在给药6 h时肿瘤中的荧光强度最强,之后由于药物代谢排泄等情况, 肿瘤部位中的药物量逐渐减少。此外,我们还可以观察到,给药后该载药纳米粒子也被 肝脏,肾脏等脏器摄取,这可能是因为纳米粒子被代谢排泄的结果。
 
图2-17不同时间点CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT载药体系在小鼠4T1肿瘤模型中的组织分布
 
2.3.13抑瘤实验结果
为了进一步探究 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 载药体系的抗肿瘤效果,我们建立 了 4T1 小鼠肿瘤模型进行抑瘤实验,抑瘤实验流程如图 2-18 所示。抑瘤实验结果如图 2-19所示,由(a)图中的小鼠体重随给药时间变化图可知,CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT 组的小鼠体重维持在一个稳定的水平,而阳性药组和生理盐水组的小鼠体重均出现了下 降,从这里我们可以看出阳性药 HCPT 的毒性作用很大,而生理盐水组体重下降是因为 小鼠未得到有效治疗,肿瘤的持续生长对小鼠的健康照成了影响,导致体重下降。图⑹ 和图(d)以及图2-20说明CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT载药体系相对于阳性药HCPT能 有较好的抑瘤效果。图(c)的脏器系数分布图说明,阳性药HCPT对肝的影响较大,而 CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT体系对脾的影响较大。脏器系数又称脏体比,是实验动物 某脏器的重量与其体重之比值。脏器系数是毒理实验中常用的指标,但他本身有一定局 限性。因此,相关的毒性结果需要与H&E组织切片染色结果相参考。
 
 
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耐测1伽1刑抓|||咖冊I抓皿帅刑加刑丽
2.3.14小鼠心肝脾肺肾以及瘤的H&E染色切片
为了进一步探究 QDs 的体内抗肿瘤活性, 我们对肿瘤组织和心肝脾肺肾脏器组织 切片进行苏木精-伊红(H & E)染色,并利用倒置荧光显微镜观察其组织损伤情况。
其中心肝脾肺肾的组织切片H&E染色结果如图2-21所示,由染色结果我们可以看 出,心肝脾肺肾的三组染色结果未表现出明显差异,说明药物的组织毒性较低。
图2-22为小鼠实体瘤H&E染色切片结果图,通过分析组织切片,我们发现与生理 盐水组相比,QDs治疗组和HCPT组的肿瘤组织切片中癌细胞蓝染部分大量减少,这表
明该肿瘤组织中的癌细胞受到破坏,而且CdSe/ZnS@DHLA-PEG-HCPT的效果更明显。
 
图2-21小鼠心肝脾肺肾H&E染色切片
 
 
Saline HCPT QDs
 
图2-22小鼠实体瘤H&E染色切片
 
2.4 本章小结
综上所述,我们合成了一种具有良好抑制肿瘤细胞增殖效果的纳米载药体系 CdSe/ZnS@DHLA -PEG-HCPT,而且其对实体瘤的治疗效果也令人满意。我们首先选用 二氢硫辛酸对量子点进行水溶性修饰,在通过酯键连接上具有良好生物相容性的 PEG 链,最后在通过酯键负载上羧基化修饰过的 10-羟基喜树碱,红外,紫外,荧光以及透 射电镜等结果表明该载药体系的成功合成,细胞实验证明该载药体系能够抑制多种肿瘤 细胞的增殖,此外流式细胞术结果显示该载药体系通过诱导细胞发生凋亡和自噬,降低 线粒体膜电位等方式导致肿瘤细胞死亡。同时,动物实验结果更加验证了该载药体系具 有较好的抗肿瘤效果,而且对正常组织器官的毒性较低,是一种有发展前景的载药体系。
46
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48
3. 肝癌靶向的超支化聚酰胺胺修饰的量子点双载药体系的合成及
其活性研究
3.1前言
肝癌是死亡率仅次于胃癌,食道癌的第三大常见恶性肿瘤[1]。我国是世界肝癌大国, 全球每年新被确诊的近70万肝癌患者中,我国占有的数量不少[2]。更让临床担忧的是, 70%的肝癌患者在发现病情之初,就已经走到了中晚期阶段[3]。且由于肝脏的供血量较 为丰富,癌细胞也容易随着血液循环转移到周围或远处器官,越是到了晚期之后,肝癌 的预后也就会越差[4]。虽然现在化学疗法,放射疗法等治疗方法在临床上用于抑制肿瘤 增殖和延长病人寿命等方面取得了巨大成功[5]。但越来越多的实践和研究中发现单一治 疗形式已经不能完全消除肿瘤且难以预防肿瘤转移[6]。因此,要克服单一疗法的局限性, 采用两种或更多种形式的联合治疗方法被认为是替代单一治疗的有效方法。先进的纳米 技术可对多功能纳米材料进行智能设计并用于共递送,共组装两种或多种治疗药物,为 肿瘤联合治疗的设想提供了有效的支持[7]。
树枝状大分子是一种新型高分子材料,其表面含有大量羧酸或胺基基团,均可以与 金属结合,起到包裹金属纳米簇和隔离溶液的作用, 从而防止金属纳米簇的团聚,因此 可以用来合成强荧光的水溶性金属纳米簇[8-9]。超支化聚合物是支化程度更高的树形大 分子,它是由Flory在1952年首次提出:由多官能团单体ABx(X22)缩聚反应可以得 到可溶性的高度支化的聚合物,它的结构有缺陷,称为超支化聚合物。
超支化聚合物比树枝状聚合物的支化程度更大,往往采用一锅法制得、反应不可控, 因此它在结构上存在缺陷,并非像树枝状大分子结构完美对称,分子链间不会相互缠绕, 分子量分布较宽,结构中含有三种结构单元,分别是末端单元、线形单元和支化单元。 如图 3-1 是树枝状聚合物和超支化聚合物的结构[10]。
 
维生素E衍生物a-生育酚琥珀酸酯(a-TOS)在多种肿瘤中发挥促凋亡作用,并为正 常组织所耐受「⑴。a-TOS结构如图3-2所示,它以线粒体复合体II为靶点,产生活性 氧(ROS),选择性地破坏癌细胞线粒体的稳定,进而触发细胞凋亡。相关研究表明,a- TOS 对癌细胞具有选择性毒性,对非癌细胞的毒性较低。在体内, a-TOS 可以很容易地 转化为a-生育酚(a-TOH),从而促进肝脏的肿瘤监测。以a-TOS为基础的临床治疗成功 的主要障碍是该药物的疏水性,这大大降低了其生物利用度和治疗活性。此外,在有机 相或油乳剂中静脉注射或腹腔注射a-TOS会产生重要的副作用,如药物与血浆混合、炎
 
 
紫杉醇是一种复杂的四环二萜类化合物(图 3-3),它可使微管蛋白和组成微管的微 管蛋白二聚体失去动态平衡,诱导与促进微管蛋白聚合、微管装配、防止解聚,从而使 微管稳定并抑制癌细胞的有丝分裂和触发细胞凋亡,进而有效阻止癌细胞的增殖,起到 抗癌作用。[13]。自1992年上市以来, 广泛用于卵巢癌、乳腺癌和非小细胞癌的治疗, 市 场需求巨大[14]。然而,紫杉醇的水溶性极小,从而造成给药困难,极大地限制了这种天 然活性产物应用于肿瘤治疗[15-16]。
50
 
 
图 3-3 紫杉醇结构式
靶向治疗是现在抗肿瘤研究的热点[17],当药物能够特异性地靶向肿瘤细胞时,能够 极大的提高药物的疗效,降低毒副作用。大量研究表明,FoxM1作为Fox家族的特殊成 员,在多种人类癌症细胞中过量表达[18],是抗癌药物治疗与干预的重要靶点,而多肽9R- P201 (图3-4)能通过下调FoxM1的表达来显著地抑制肝癌HepG2细胞的增殖并能诱 导其发生凋亡。[19]。
 
Arg-Aig-Arg-Arg-Arg-Aig-Arg-Arg-Arg-Gly-Ser-Gly-Ser-Trp-His-Leu-Asp-Tyi-Pro-SerMet-Trp-Tyr-Leii-Asp
 
 
 
图3-4 9R-P201的两种构型,本实验选用D构型的9R-P201
 
因此我们合成了具有靶向作用的双载药纳米体系(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)- SS-PTX-9R-P201,并对该载药体系进行一系列的生物活性检测,检测结果表明该载药体 系对肝癌细胞 HepG2 的抑制增殖效果要明显好于其他癌细胞,说明有一定的选择性。 流式结果表明,该载药体系通过降低线粒体膜电位,增加细胞内活性氧含量来诱导细胞 凋亡以及自噬,从而达到抗肿瘤效果。动物实验结果表明,该纳米载药体系具有良好的 治疗小鼠肝癌实体瘤H22的效果,并对其其他组织和器官的毒副作用较小,因此,该纳 
米载药体系是一种具有良好发展潜力的新型纳米药物递送系统。
3.2实验部分
3.2.1主要试剂
表 3-1 实验所需主要试剂
名称 供应商
D-a-生育酚琥珀酸酯(a-TOS) 麦克林
紫杉醇(PTX) 阿拉丁
9R-P201 上海强耀生物科技有限公司
 
其余主要试剂参考 2.2.1
3.2.2主要仪器
同 2.2.2
3.2.3主要溶液的配制
同 2.2.3
3.2.4CdSe/ZnS 量子点的合成
前驱体及CdSe/ZnS的制备参考2.2.4
3.2.5超支化聚酰胺胺的合成
(1)乙二胺-丙烯酸甲酯( 1:1)聚合前体的合成
参考刘[20]文献中的方法进行合成:在150 mL圆底烧瓶中加入19.90 g的乙二胺, 随后加入5 mL甲醇,置于冰盐浴中进行搅拌,使乙二胺充分溶于甲醇中。取30 mL丙 烯酸甲酯置于恒压滴液漏斗中,用20 mL甲醇稀释后,以每秒1-2滴的速度往烧瓶中 滴加丙烯酸甲酯,滴加完毕后,用 5 mL 甲醇淋洗滴液漏斗并继续滴加到反应体系中, 用翻口橡皮塞将反应体系密封好,并置于常温下电磁搅拌反应 48 h。
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(2)超支化聚酰胺胺的合成
参考刘[20]文献中的方法进行合成:超支化聚酰胺胺的合成路线如图3-5所示,将盛 有乙二胺-丙烯酸甲酯聚合前体的反应瓶套在旋转蒸发仪上,用真空泵抽真空,以 100 rpm的转速高速旋转,并将水浴锅升温至60。0在60 °C下反应1 h,抽走溶剂甲醇; 然后,将水浴换成油浴,升温至100 °C,在100 C下反应2 h;最后,升温至140 C, 在140 C下反应2 h。此时,反应体系粘度较大,停止加热,撤去油浴。当体系冷却至 常温后,停止旋转,得到一种浅黄色的粘稠物,即超支化聚(乙二胺-丙酸烯甲酯),其 结构如图 3-6 所示。
提纯:将得到的浅黄色的粘稠物溶于氯仿中,用大量乙醚沉淀,在40 C下真空干 燥48 ho重复两次。另外,由于剩余的反应物在高温低压下基本已经被抽走,故不必再
提纯。
 
图 3-5 超支化聚酰胺胺的合成路线图
 
 
 
图 3-6 超支化聚酰胺胺的结构图
 
3.2.6载药纳米粒子合成步骤
(1) (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX 的合成
(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX 载药体系合成路线如图 3-7 所示,取合成的 超支化聚酰胺胺(HPAMAM)溶于15 mL氯仿中,在向其中加入合成的CdSe/ZnS量子 点,超声波超声1 h,经修饰后的量子点呈红色并漂浮于氯仿层上,将得到的产物吸取 出来,并用丙酮沉淀离心,重复操作三次后,得到超支化聚酰胺胺修饰的量子点。
将0.050 g a-生育酚琥珀酸酯溶于DMSO中,再加入0.019 g EDC和0.010 g DMAP 来活化羧基,室温搅拌1 h后,逐滴加入到溶于DMSO中的修饰后的量子点溶液中,然 后室温搅拌48 h。得到的产物进行丙酮沉淀,离心,得到负载上a-生育酚琥珀酸酯的量 子点载药体系。将该产物用DMSO彻底洗涤,离心收集,重复三次后,得到的上清液进 行旋蒸以除去丙酮,然后进行紫外检测,以计算上清液中未负载上的a-TOS药物量,从 而推算出 a-TOS 的负载量。
再将上述产物溶于DMSO中,加入3滴三乙胺,再加入用0.020 g EDC和0.02 g DMAP活化过的0.20 g 3,3'-二硫代二丙酸溶液,室温搅拌24 h,得到的产物丙酮沉淀离 心后,再用DMSO洗涤重复三次,以彻底除去残留的催化剂和原料药,得到带有二硫键 和羧基化的载药体系。
再将上述合成的产物溶于溶于DMSO中,再加入0.020 g EDC和0.010 g DMAP来 活化羧基,室温搅拌1h后,向该体系中逐滴加入溶于DMSO的紫杉醇(0.050 g)溶液, 室温搅拌48 h后,丙酮离心收集产物,并收集上清液。从而得到负载有紫杉醇和a-生
育酚琥珀酸酯的双载药体系。
 
CdSc/ZnS CdSe/ZnS@HPAMAM CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS ( CdSe/ZnS@HPAMAM-ct-TOS)-S-S-PTX
 
 
 
a-生育酚琥珀酸酯(a-TOS) 紫杉醇(PTX)
 
图 3-7 (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX 载药体系合成路线图
(2) (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 的合成
合成方法如图3-8所示,称取0.0500 g 9R-P201肽溶解于装有5 mL三蒸水的25 mL 圆底烧瓶中,用适当的速度进行搅拌,搅拌状态下加入0.020 g EDC和0.020 g NHS,室
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温活化 9R-P201 上的羧基 0.5 h,然后加入(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX,室 温黑暗条件下反应24 h,离心收集固体,用三蒸水充分溶解后,冷冻干燥48 h,得到 (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 红色固体。
 
(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-S-S-PTX ( CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-S-S-PTX-9R-P201
9R-P201 肽
 
图 3-8 (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 载药体系合成图
( 3)合成 CdSe/ZnS@HPAMAM-S-S-PTX 载药体系
合成路线如图3-9所示,取合成的超支化聚酰胺胺(HPAMAM)溶于15 mL氯仿 中,在向其中加入合成的CdSe/ZnS量子点,超声波超声4 h使量子点完全被超支化聚 酰胺胺修饰上,此时可以看出修饰后的量子点呈红色并漂浮于氯仿层上,将得到的产物 吸出,并用丙酮沉淀离心,重复操作三次后,真空干燥得到超支化聚酰胺胺修饰的量子 点。
再将上述产物溶于DMSO中,再加入用0.20 g EDC和0.20 g NHS活化过的3,3' -二硫代二丙酸(DTDP, 0.20 g)溶液,室温搅拌24 h,得到的产物丙酮沉淀离心后,再用 DMSO 洗涤重复三次,以彻底除去残留的催化剂和原料药。
再将上述合成的产物溶于溶于DMSO中,再加入0.020 g DCC和0.010 g DMAP来 活化羧基,室温搅拌1 h后,向该体系中逐滴加入溶于DMSO的紫杉醇(0.050 g)溶液, 室温搅拌 48 h 后,丙酮离心收集纯化产物,并收集上清液。从而得到负载有紫杉醇的 CdSe/ZnS@HPAMAM-S-S-PTX 单载药体系。
然后将该单载药体系分别与 CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS 单载药体系,以及 (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-S-S-PTX双载药体系进行相关检测。
 
CdSe/ZnS CdSe/ZnS@HPAMAM CdSe/ZnS@HPAMAM-S-S-COOH CdSe/ZnS@HPAMAM-S-S-PTX
 
图 3-9 CdSe/ZnS@HPAMAM-S-S-PTX 载药体系合成路线图
3.2.7纳米载药体系的表征
实验操作参考2.2.6
3.2.8细胞的培养
实验操作参考 2.2.8
3.2.9细胞毒性检测
实验操作参考 2.2.9
3.2.10竞争性抑制摄取检测
将处于对数生长期的HepG2细胞,以相似的密度接种于两块六孔板中,置于37 °C、 5 % CO2的培养箱中培养一天,待细胞生长至合适的密度后,吸去培养基,分为两组。 然后其中一组中的五个孔各加入2 mL浓度为5 yg/mL的(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)- SS-PTX-9R-P201的培养基,在与细胞共孵育1 h、2 h、4 h、6 h、8 h后收集细胞,最后 一个孔为对照,加入 2 mL 新鲜培养基培养细胞 8 h 后,同样进行细胞的收集,将六孔 板中的所有细胞收集于1.5 mL EP管中,并标记,以2000 rpm离心10 min后,弃去上 清液,分别加入 600 yL PBS 重悬后用筛网过滤,用流式细胞仪检测荧光强度。另一组 六孔板中的细胞,首先向其中每个孔中加入1 mL浓度为500 yg/ml的9R-P201肽的培 养基,与细胞共孵育0.5 h后,吸去,再向其中五个孔各加入2 mL浓度为5 yg/ml的 (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 的培养基,同样地,在与细胞共孵育 1 h、2 h、4 h、6 h、8 h后收集细胞,最后一个孔为对照,加入2 mL新鲜培养基培养细胞 8 h后,同样进行细胞的收集,将六孔板中的所有细胞收集于1.5 mL EP管中,并标记,
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以2000 rpm离心10 min后,弃去上清液,分别加入600 yL PBS重悬后用筛网过滤,用 流式细胞仪检测荧光强度。
3.2.11细胞成像
实验操作参考 2.2.10
3.2.12对细胞凋亡的影响
实验操作参考2.2.11
3.2.13对细胞自噬的影响
实验操作参考2.2.12
3.2.14对细胞线粒体膜电位的影响
实验操作参考2.2.13
3.2.15对细胞活性氧含量的影响
实验操作参考2.2.14
3.2.16生物体内分布
实验操作参考2.2.15
3.2.17对肿瘤的抑制效果
实验操作参考2.2.16
3.3 结果与讨论
3.3.1超支化聚酰胺胺的核磁结果表征
图 3-10 为超支化聚酰胺胺合成过程中不同阶段的核磁氢谱图,其中编号为1, 2,
3, 4的图谱分别是终产物HPAMAM (油浴140 C反应2 h),油浴140C反应1 h,水浴
60 C反应1 h,乙二胺-丙烯酸甲酯(1:1)聚合前体,以及反应物丙烯酸甲酯。
编号4我们可以看到在5.48 ppm, 6.49 ppm处的峰在随后的反应中消失,该处的峰 为丙烯酸甲酯的双键氢谱峰,这些峰的消失说明乙二胺的活泼氢与a-卩不饱和羰基化合 物丙烯酸甲酯的双键进行 Michael 加成反应成功,生成(乙二胺-丙烯酸甲酯)聚合前 体。而随着反应的进行,我们可以从图谱中看出,不同的反应阶段,峰的位置和强度出 现了变化,说明有新的产物生成。
图3-11为超支化聚酰胺胺的核磁氢谱图,其结果为1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) 68.43-8.24 (-NH-), 3.81-3.38 (OCH3), 3.32-2.94 (NCH2), 2.91-2.37(COCH2CH2NH, NHCH2CH2NH, NHCH2CH2NH2), 2.37-2.06 ( NH2, NH) 1.13-1.03 (-CH3)
 
 
 
图3-11超支化聚酰胺胺HP(EDA-MA)的核磁氢谱图
 
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3.3.2纳米载药体系的紫外和荧光表征
纳米载药体系的紫外,荧光图谱如图3-12所示,由图(a)我们可以看出量子点在被 超支化聚酰胺胺修饰后 310 nm 左右处出现了新的吸收峰,说明修饰成功,然后在连接 其他化合物时,吸收峰的峰型和位置出现了不同的变化,说明整个体系的合成成功。
由图(b)我们可以看出量子点的荧光峰在610 nm左右,在被修饰后荧光峰发生蓝移, 荧光强度略有降低,并在 490 nm 左右处出现了超支化聚酰胺胺的荧光峰,说明修饰成 功。然后在负载阳性药 a-TOS 和 PTX 后,荧光峰的峰型,峰位置也发生变化,说明整 个体系的合成成功。
我们通过紫外分光光度计检测了不同浓度下a-TOS和PTX最大吸收峰处的吸光度 值,得到了 a-TOS的浓度与吸光度值得标准曲线:y=0.0045x+0.0079(R2=0.999), PTX的 浓度与吸光度值得标准曲线:y=0.0042x+0.0537(R2=0.998),从而根据载药率公式(公式2- 2)和包封率公式(公式 2-3)得到(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 载药 体系中,a-TOS的包封率为81.92 %,载药率为45.83 %, PTX的包封率为43.85 %,载 药率为12.97 %。
 
图 3-12 (a)为(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX 载药体系紫外图;(b)为(CdSe/ZnS@HPAMAM-
 
a-TOS)-SS-PTX 载药体系荧光图
3.3.3纳米载药体系的形貌
我们用透射电镜对纳米粒子的形貌进行直观的检测,结果如图3-13所示,由图(a)
中我们可以看出CdSe/ZnS量子点粒径大小均一,呈圆球形,粒径大小为4.42 nm左右; 图(b)我们可以看出终产物(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201的粒径明显 增加,约为7.26 nm,但仍保持良好的分散性。
 
图 3-13 (a)为 CdSe/ZnS 量子点透射电镜图,(b)为(CdSe亿nS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 透射电镜图
 
3.3.4纳米载药体系的Zeta电位
纳米颗粒通过表面修饰降低表面势能,同时也通过引入新的基团,给纳米颗粒带来 新的特性,如表面电荷等。而纳米粒子的表面电荷影响着细胞摄取情况,由于肿瘤微酸 性环境的存在, 一般来说带正电的纳米粒子更易进入被摄取, 因此我们进行了 (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 载药体系的 Zeta 电位检测实验。
实验结果如图 3-14 所示, 可以看出修饰后的量子点 Zeta 电位图, CdSe/ZnS@HPAMAM的电位为35.6 mV,这是因为带负电荷的量子点表面修饰上了带大 量氨基的超支化聚酰胺胺的原因。连接上阳性药a-TOS后,电位值降低,这是因为a- TOS 中的羧基与修饰在量子点表面的氨基发生酯化反应,从而导致正电性下降。 CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS-SS-COOH 的呈现电负性,这是因为实验中投入了过量的 3,3'-二硫代二丙酸,导致体系的表面电荷降低。连接上PTX 后,体系裸露的羧基官能团 被占据一部分,故电荷有所升高。在连接上正电性的 9R-P201 多肽后,体系的表面电荷 升为正值。此实验结果从侧面说明该纳米体系的合成成功。
60
 
 
图 3-14 (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 载药体系 Zeta 电位值
 
3.3.5细胞毒性实验结果
通过汇总的MTT结果(表3-2)可以看出,对不同细胞来说,结果显示连上9R-P201 肽后该载药体系对癌细胞的抑制效果均优于未连接前的效果,这可能是因为因为 9R- P201 肽的靶向作用使整个载药体系更易进入细胞,发挥药效。
对不同细胞来说,结果显示连上 9R-P201 肽后载药体系对肝癌细胞 HepG2 的抑制 效果(IC50=4.5 yg/mL)为对正常肝细胞抑制效果(IC50=89.3 ±4.5 yg/mL)的20倍左右, 显著高于未连接9R-P201肽的载药体系的效果,这说明9R-P201肽发挥了靶向肝癌细胞 的效果。
连上 9R-P201 肽后终载药体系对另一种肝癌细胞 SNU-739 的抑制效果优于 (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX的效果大概3倍左右,而连上9R-P201肽后终 载药体系对HepG2细胞的抑制效果优于(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX的效果 大概13倍左右,靶向HepG2效果还是比较明显的。
表 3-2 (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 载药体系 IC50 值
Ding IC5o(pg/inL)
A549 HL-7702 HepG2 SNU-739
CdSe/ZnS@HPAMAM >500 >500 >500 >500
CdSe/ZnS@HPAMAM-a-
TOS >500 355.24±9.73 166.36+4.90 345.56±7.89
CdSe/ZnS@HPAMAM-SS-
PTX 277.71 ±2.50 286.32±5.25 114.92 土 1.93 148.23 + 2.40
(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-
TOS)-SS-PTX 176.63 ±4.82 189.74 ±4.92 60.25 + 1.16 46.19 + 0.52
(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-
TOS>SS-PTX-9R-P201 37.13±3.20 89.34 ±4.53 4.52±1.33 15.39+2.62
a-TOS 51.02±0.48 81.83 ±2.30 32.31+3.17 72.37±3.98
PTX 0.40 + 0.05 0.47 + 0.12 0.36 土 0.06 0.48+0.11
 
3.3.6纳米载药体系的细胞成像结果
细胞对药物的摄取量直接影响着纳米药物能否起到抑制肿瘤细胞增殖的效果,因此 我们选用三种不同的细胞HepG2肝癌细胞,HL-7702正常肝细胞,A549非小细胞肺癌 细胞,来检测它们对(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201纳米载药体系不同 时间段的摄取情况,检测结果如下图3-15,图3-16,图3-17所示。
由图可以看出,随着时间的延长,细胞内的荧光强度增强,细胞对药物的摄取量增 多。而且在相同时间点,HepG2细胞摄取的药物量要明显高于HL-7702细胞和A549 细胞,这很好的说明了该载药体系对HepG2细胞的靶向效果。
62
 
 
图 3-15 HepG2 细胞对(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201(5 yg/mL)不同时间段的摄取
 
图 3-16 HL-7702 细胞对(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201(5 yg/mL)不同时间段的摄
取情况
 
 
图 3-17 A549 细胞对(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201(5 yg/mL)不同时间段的摄取情
3.3.79R-P201 肽竞争性摄取检测结果
文献报道9R-P201具有很强的肝癌靶向性,因此为了更直观的考察 (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 对肝癌细胞的靶向作用,本研究将其 中一组 HepG2 细胞经过 9R-P201 肽预处理,提前与细胞上的相关受体结合,再和另一 组细胞加入等量的(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201纳米药物,进行不同 时间段的摄取情况考察。
流式细胞仪检测结果如图3-18, 3-19所示,其中3-19中的图(a)为500 mg/mL9R- P201 肽作用 HepG2 细胞 0.5 h 竞争占据相关受体后再加浓度为 5 yg/mL 的 (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 药物孵育,作用一定时间的 HepG2 细 胞吸收荧光结果叠加图;图(b)为单独用浓度为5 yg/mL的(CdSe/ZnS@HPAMAM-a- TOS)-SS-PTX-9R-P201药物孵育,作用一定时间的HepG2细胞吸收荧光结果叠加图。
由实验结果可以看出,随着作用时间延长,两组数据均显示 HepG2 细胞吸收荧光
64 
强度增加,但是同样作用时间下,b组药物进入HepG2细胞中的比a组更多,这说明当 9R-P201 肽将细胞上的相关靶向受体占据后,药物进入细胞中的量减少,侧面说明
CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 对 HepG2 细胞具有靶向性。
(a) 9R-P20I肽作用HepG2细胞0.5 h竞争占据相关受体后再加浓度为5pg/mL 的(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 药物共孵育
 
图 3-18 不同处理的 HepG2 细胞对于药物(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 的
 
 
 
图 3-19 不同处理的 HepG2 细胞对于药物(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 的摄
取结果叠加图
 
3.3.8对细胞凋亡的影响结果
我们 用 流式细 胞 仪检测 (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 , (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS,
CdSe/ZnS@HPAMAM-SS-PTX, CdSe/ZnS@HPAMAM, a-TOS, PTX 对 HepG2 细胞的 诱导凋亡情况。由图3-19可知,纳米载体CdSe/ZnS@HPAMAM与细胞共孵育后,对细 胞几乎无影响,而负载了阳性药物a-TOS和PTX之后,细胞凋亡明显增多,而且双载 药体系明显优于单载药体系的凋亡效果。再连接上靶向多肽 9R-P201 后,同等药量下,
(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 的凋亡效果相比于
(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX更加显著,说明该靶向纳米载药系统具有更好的
进入细胞诱导凋亡的效果。
 
图3-20流式细胞仪检测纳米载药体系与HepG2细胞共孵育后对细胞凋亡的影响(Annexin V-PI染
色)
3.3.9对细胞自噬的影响结果
(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 与 HepG2 细胞共孵育后,用 MDC
染色,用流式细胞仪检测细胞的自噬效果。 如图 3-20 所示,纳米载药体系
(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 与 HepG2 细胞共孵育后,可以增强
HepG2 细胞自噬,且效果明显优于其他组的纳米药物以及阳性药,说明该纳米载药体系 具有良好的促使细胞自噬的效果,且与药物浓度呈正比。
 
3.3.10对细胞线粒体膜电位的影响结果
细胞的线粒体膜电位与凋亡的发生有关,因此我们检测了(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-
TOS)-SS-PTX-9R-P201 对 HepG2 细胞线粒体膜电位的影响,检测结果如图 3-21 所示, 由图中我们可以看到(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 与 HepG2 细胞共 孵育后,随着药物浓度的增加,细胞内的绿色荧光逐渐增强,说明两者呈正相关。绿色 荧光增强说明线粒体膜电位降低,由此可知该纳米载药体系的线粒体膜电位降低的程度 明显高于其他药物,说明该载药体系具有良好的降低线粒体膜电位的效果。
 
 
 
 
图3-22流式细胞仪检测药物与HepG2细胞共孵育后对细胞细胞线粒体膜电位的影响(JC-1染色)
3.3.11对细胞活性氧含量的影响结果
细胞活性氧含量选用二氢乙锭(DHE)进行检测,它进入细胞后,在细胞内超氧化物 的作用下脫氢,生成有红色荧光的溴化乙锭,从而通过红色荧光强弱,检测出细胞内ROS 含量的高低。如图 3-22 所示, (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 肽体系 与单载药体系以及未连接靶向肽的双载药体系的活性氧检测结果显示,随着药物 (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 浓度的增加,活性氧含量升高,而高的
ROS 水平可有效地诱导细胞凋亡,这与凋亡的检测结果相符。
 
 
3.3.12纳米载药体系的小鼠体内分布结果
为了探究(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201纳米载药体系进入小鼠
体内后的分布情况,我们用荷 H22 瘤的小鼠进行实验,在尾静脉给 5 mg/kg 的
(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201纳米载药体系后,分别解剖给药后1 h、 2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 时间点的小鼠心肝脾肺肾以及肿瘤组织,进行荧光成像 拍照,结果如图 3-23 所示。
由结果可知药物进入小鼠体内后在12 h时,药物在肿瘤组织内聚集的最多,荧光最
强,其他组织器官中,肝脏和肾中的荧光较强,这可能是因为药物经过肝肾代谢,有少 许在其中分布聚集。
 
图 3-24 小鼠组织荧光成像图
 
68
3.3.13纳米载药体系对肿瘤的抑制效果
抑瘤实验是表征药物是否具有持续的治疗能力的一个重要手段,因此我们选择生理 盐水组为对照组, PTX, a-TOS 和 CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS, CdSe/ZnS@HPAMAM-
SS-PTX, (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX, (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS- PTX-9R-P201进行实验。我们建立了荷H22的小鼠肝肿瘤模型,在肿瘤生长到100 mm2 左右时,分组标记,开始尾静脉给药,隔天给药并称重,量瘤体积,共给药五次,在给 药第12天后解剖,取出小鼠的心肝脾肺肾瘤分别进行称重,结果如下图所示。
由图3-24(b)中小鼠体重变化曲线我们可以看出,阳性药物给药后,小鼠的体重严重 下降,说明药物的毒副作用较大,而对比可以看出(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS- PTX-9R-P201组小鼠较为健康,体重未受到明显影响。由图3-24的瘤体积图(a)和瘤重 图(c)以及小鼠肿瘤解剖图(图3-25 )我们可以看出,相较于其他载药体系, CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 纳米载药体系表现出了更好的抑瘤效果。
(a)
 
linw (dan)
(b), (c)
 
 
图3-25 (a)小鼠肿瘤体积随时间的变化曲线,(b)小鼠体重随时间的变化曲线,(c)解剖后的瘤重图
 
图 3-26 小鼠肿瘤解剖图片
 
3.3.14H&E染色以及TUNEL染色结果
我们对实验小鼠的心肝脾肺肾进行H&E染色,结果如图3-26所示。由图中我们可
以看到各组小鼠的心肝脾肺肾组织切片染色结果未见明显差别,说明药物对这些组织器
 
图3-27小鼠心肝脾肺肾H&E染色结果
接下来,我们对各组小鼠肿瘤组织进行了 H&E染色和TUNEL染色,染色结果如 图 3-27 所示。其中(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 纳米载药体系给药 组的小鼠肿瘤组织中,H&E染色的蓝染部分明显较生理盐水组少,说明细胞死亡增多, 而 TUNEL 染色结果则说明这是细胞凋亡造成的。 各组肿瘤组织的凋亡情况为
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(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201>(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS- PTX> CdSe/ZnS@HPAMAM-SS-PTX>PTX> CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS>a-TOS>saline, 该结果与流式的凋亡检测结果相符,说明(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-
P201 纳米载药体系有很好的诱导肿瘤细胞发生凋亡的效果。
 
图3-28小鼠瘤H&E和TUNEL染色结果
 
3.4 本章小结
我们选用超支化聚酰胺胺对量子点进行水溶性修饰,然后通过化学键结合的方式先 后负载上抗肿瘤药物a-TOS以及PTX,最后再通过酰胺键连接上肝癌靶向肽9R-P201, 得到具有肝癌靶向作用的双载药纳米体系(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R- P201 。 实 验 结 果 显 示 与 两 种 单 载 药 体 系 CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS , CdSe/ZnS@HPAMAM-SS-PTX 相比,双载药体系(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX 表现出了 更好的肿瘤抑制效果。此外, 连接上 9R-P201 的纳米载药体系 (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX-9R-P201 的肝癌细胞抑制增殖效果明显好于 (CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)-SS-PTX 载药体系,说明(CdSe/ZnS@HPAMAM-a-TOS)- SS-PTX-9R-P201 载药体系对肝癌细胞具有靶向作用。因此,我们可以说该载药体系能 够选择性靶向肝癌细胞,并产生较好的治疗效果,具有一定的应用前景。
 
 
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