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血清脂肪细胞因子与类风湿关节炎患者肌少症 及骨质疏松的相关性研究

发布时间:2022-08-11 11:45
1 引言
类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的自身免疫性疾病,其慢性持续的滑膜炎主要造成机体关节结构的损伤及关节功能的丧失[1]。在过去的研究中,多种细胞因子如 TNF-α、IL-6、IL-1、GM-CSF 等在 RA 的发病机制中起着重要作用已基本成为业内共识[2],近年来也陆续有不少究将焦点集中在脂肪细胞因子(adipocytokine)上,目前已经发现的脂肪细胞因子种类众多,其中包括脂联(adiponectin),瘦素(leptin),内脂素(visfatin)以及抵抗素(resistin)等较为被熟知。脂肪细胞因子作为一类多效分子,现阶段的学术研究表明它们除了在脂质代谢中不可或缺的角色以外,也可以导致机体持续维持一种低炎症状态,作用于机体内各种复杂机制,进而引发机体多种代谢异常,这些均提示脂肪细胞因子极有可能在自身免疫病和炎症性疾病中发挥作用,导致此类患者的骨骼关节乃至肌肉的结构功能发生进一步损害[3]。骨质疏松(osteoporosis,OP)是以单位体积内骨量减少、结构破坏为主要特征的一种全身性疾病,通过增加患者骨的脆性,从而提高发生骨质疏松性骨折(osteoporotic fracture, OPF)的概率,OP 最多见于老年女性[4],是 RA 患者在病程后期发生残疾的一大重要原因。肌少症是一种因骨骼肌肌肉生理功能减退或者骨骼肌肌肉强度下降,最终导致患者肌力及骨骼肌肌肉活动能力下降的综合征[5]。近年来有关脂肪细胞因子在肌少症和 OP 中的研究越来越得到广泛的关注,现有的研究结果认为脂肪细胞因子与炎症反应及代谢异常存在密切关系[6],而脂肪细胞因子中的脂联素及瘦素在 RA 患者体内的变化以及相关临床意义已有诸多学者进行研究探讨,这为 RA 的诊断及疾病活动度的评估提出了新的思路和评价标准。但其他因子如内脂素及抵抗素在 RA 患者体内的改变情况以及它们是否对 RA 疾病活动度、骨与关节改变、骨骼肌肉量等产生影响,是否影响RA 患者同时合并及发生肌少症等,仍有待更多研究探索。本研究主要探索血清内脂素和抵抗素水平在 RA 患者中的变化及临床意义以及是否与 RA 患者合并肌少症
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和 OP 相关。内脂素,原先被研究人员命名为 B 淋巴细胞前体的生长因子(pre-B-colonyenhancing factor, PBEF),因其具有胞内酶活性又被称为烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nicotinamide phosphoribosyl transferase,NAMPT),内脂素能够在合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的过程中发挥一定作用,其基因定位于染色体 7q22.1 和 7q33.1 之间,长度为 347KB,由 473 个氨基酸组成。内脂素在人体多数器官中均有稳定表达,最常见于肝脏、骨骼肌和骨髓,并且广泛作用于 NAD+相关的各类重要细胞活动,与细胞增殖、分化及凋亡相关,现有研究表明内脂素可通过激活炎症反应通路,从而增强炎性因子的表达[7-8]。抵抗素又被称为脂肪细胞特异性表达因子(adipose-tissue-specific secretoryfactor, ADSF),同时因最初发现其与肺部炎症相关,研究人员又将其命名为 FIZZ3(found in inflammatory zone 3),抵抗素由 RSTN 基因编码,分子量大小为 12.5KD,由 108 个氨基酸构成。人体外周血单核细胞、巨噬细胞和骨髓细胞是抵抗素常见的表达细胞,但其作用机制尚未完全明了,现有的研究证实抵抗素主要参与血糖控制、脂质代谢,并在促炎细胞因子的合成与分泌过程中起到作用,在影响血管生成,心脏收缩力,骨重塑等多种生理过程中均起到一定影响[9-10]。本研究将探寻 RA 患者血清内脂素和抵抗素水平的变化以及它们的临床意义,同时探寻血清内脂素水平和血清抵抗素水平与 RA 患者合并肌少症及骨质疏松之间存在何种相关性。


2 资料与方法
2.1.研究对象
2.1.1 RA组入组标准
选取 2019 年 12 月到 2020 年 12 月期间于我院风湿免疫科病房治疗的 RA 患者共 182 例,其中女性占比 78.02%(142 例),男性占比 21.98%(40 例),年龄 20~89岁,平均年龄(57±13)岁,体重指数(body mass index, BMI)13.27~38.46 kg/m2,平均 BMI(22± 4)kg/m2。入组的 RA 患者全部达到美国风湿病学会(American
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College of Rheumatology, ACR) 1987 年 RA 分类诊断标准(见表 1)以及 2010 年ACR 和欧洲抗风湿病联盟(European League Against Rheumatism, EULAR)的 RA最新分类标准(见表 2)[11]。表 1 ACR 1987年类风湿关节炎分类标准Tab 1 The 1987 ACR classification criteria for RA1. 关节内或周围晨僵持续至少 1 小时(≥6 周)2. 至少同时有 3 个关节区软组织肿或积液(≥6 周)3. 腕、掌指、近端指间关节区中,至少 1 个关节区肿(≥6 周)4. 对称性关节炎(≥6 周)5. 有类风湿结节6. 血清类风湿因子(Rheumatoid Factor, RF)阳性(滴度>1:32)7. X 线片改变(至少有骨质疏松和关节间隙狭窄)注:凡符合上述 7 项中 4 项者可诊断为 RA(要求低 1-4 项病程至少持续 6 周)表 2 2010 年 ACR/EULAR 的 RA 分类标准Tab 2 The 2010 ACR/EULAR classification criteria for RA项目 评分关节受累情况(0-5 分)1 个中到大关节 0 分2-10 个中大关节 1 分1-3 个小关节 2 分4-10 个小关节 3 分超过 10 个小关节 5 分血清学(0-3 分)RF 和抗 CCP 抗体均阴性 0 分RF 或抗 CCP 抗体低滴度阳性 2 分RF 或抗 CCP 抗体高滴度阳性 3 分急性期反应物(0-1 分)CRP 和 ESR 均正常 0 分CRP 或 ESR 异常 1 分症状持续时间(0-1 分)<6 周 0 分≥6 周 1 分
安徽医科大学硕士学位论文注:按以上标准评分 6 分或以上,可确诊为 RA。受累关节指关节肿胀疼痛,小关节包括:掌指关节、近端指间关节、第 2-5 跖趾关节、腕关节,不包括第一腕掌关节、第 1 跖趾关节和远指间关节;大关节指肩、肘、髋和膝关节。血清学高滴度阳性指>3 倍正常值。

2.1.2 正常对照组
招募同一时段前往我院体检中心进行体检的健康人群 100 名,确保其年龄分布、性别组成情况与研究入组的 RA 患者相匹配,并将其设置为对照组,对照组中女性占 77%(77 例),男性占 23%(23 例 ),年龄 22~88 岁,平均年龄(56±11)岁,体重指数 16.72~33.97kg/m2,平均 BMI(23±4)kg/m2。RA 组和健康对照组之间的性别占比、年龄分布和体重指数等基本指标间具备良好可比性,不存在统计学差异(P>0.05),见表 3。表 3 RA 患者和对照组的一般情况Tab 3 Characteristics of patients with RA and control group指标 对照组(n=100) RA(n=182) x2/t P男/女 23:7740:142 0.195 0.845年龄(岁) 55.60±11.23 57.48±12.60 1.254 0.211BMI(kg/cm2) 23±4 22±4 0.184 0.843


2.1.3 RA组排除标准
1) 同时合并糖尿病、原发性高血压、心血管疾病、肿瘤等慢性疾病;2) 同时合并有严重RA并发症;3) 合并有心脏、肝脏、肾等重要脏器功能严重异常;4) 同时合并有内分泌、血液系统的疾病;5) 血清转氨酶、血肌酐和尿素氮指标升高超出1.5倍标准值;6) 同时合并有各类微生物感染或伴随其他传染性疾病;7) RA患者在经研究者评估后发现存有其他不宜入组的情况。

2.2临床资料收集:
2.2.1一般资料
对所有招募入组的受试者的一般资料(包括性别、年龄、身高、体重以及病程等)进行详尽的记录,将身高体重换算为体质量指数(body mass index,BMI)。
 
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记录入组的RA患者的疾病活动性指标包括:关节肿胀数(swollen joint count, SJC),关节压痛数(tender joint count,TJC)、晨僵时间;记录的实验室指标包括:C 反应蛋白(C reactive protein,CRP)、类风湿因子(rheumatoid factor, RF)、抗环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptides,CCP)抗体、红细胞沉降率(erythrocytesedimentation rate, ESR)。通过视觉模拟标尺(visual analogue scale, VAS)评分(0~10cm)评价 RA 患者对自身病情的整体评估(patient global assessment, PGA),同时记录医生对患者病情的总体评估(physician global assessment, PhGA)、28个关节疾病活动指数(disease activity score in 28 joints,DAS28)、健康评估问卷评分(health assessment questionnaire, HAQ)。患者临床疾病活动指数(clinical diseaseactivity index, CDAI)、简化疾病活动指数(simplified disease activity index, SDAI)同样被记录分析。本研究采用 Mecall Castor-50-hf 型号 X 线扫描仪对受试的 RA 患者进行双手 X 线摄片,并邀请 2位专业放射科医师在互不干扰条件下独立阅片,对RA 患者进行 X 线分期(I、II、III、IV 期)和 Sharp 评分。本研究所有受试者均在充分了解此次研究内容后签署知情同意书。


2.2.2 四肢骨骼肌质量测定和肌少症的诊断标准
受试者骨骼肌肉量等各项人体成分指标采用韩国 Inbody720 人体成分分析仪测量,测量方法为直接节段多频率生物电阻抗法,依此得出受试者的骨骼肌质量指数(skeletal muscle mass index,SMI)、体脂百分比、脂肪质量指数(fat mass index,FMI)及肌少症发生率。本实验中对肌少症的评定标准参考了肌肉衰减综合征中国专家共识,其中定义 SMI 值为受试者四肢骨骼肌质量与身高的平方比值(单位:/m²),肌少症诊断标准定义为:当受试者 SMI 值较同种族年轻成年人骨骼肌质量平均值减低 2 个标准差或通过 DXA 法测定后男性<7.0kg/m2、女性<5.4kg/m2或运用 BIA 法测得男性<7.0kg/m2、女性<5.7kg/m2。[12]2.2.3 骨密度的测定和 OP的诊断标准本研究采用 GE Lunar Prodigy 双能 X 线骨密度仪对受试对象的股骨颈(Neck)、总髋部(total hip)及腰椎 L1~L4 的骨密度(bone mineral density,BMD)进行测量 ,BMD 的单位为 g/cm2。研究中对 OP 的诊断标准参考了中华医学会骨质疏松与骨矿盐疾病分会在 2017 年发布的指南[13],将 BMD 值低于同性别、同种族健康成
 
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人的骨峰值 1 个标准差之内的情形归类为骨量正常;当 BMD 降低 1~2.5 个标准差时分类为为骨量降低;而 OP 则被定义为 BMD 降低等于或超过 2.5 个骨峰值标准差。严重 OP 被定义为当受试者 BMD 符合 OP 诊断标准基础上,同时出现全身一处或多处脆性骨折的情况。OPF 定义为在 OP 的基础上由于轻微暴力骨折引发的骨折。

2.3 疾病活动度评分(DAS28、SDAI、CDAI评分):
DAS28 是一项能有效评价 RA 患者病情活动度的指标, EULAR 推荐临床医生在对 RA 患者病情评估时使用 DAS28,以此来制定适合患者的诊疗方案[14-15],在临床上通常采用 Miwa 法对 DAS28 进行计算[16]:DAS28 =0.56 ×sqrt (TJC28)+0.28×sqrt (SJC28 )+ 0.70×In (ESR) + 0.014×PGA (PGA:VAS 0~10 cm)。本研究中使用的 DAS28 分组标准[17]:DAS28 分值<3.2 分则为低疾病活动组;DAS28 分值3.2~5.1 分时定义为中度活动组;DAS28 分值>5.1 分时定义为重度活动组。采用Miwa 法对 SDAI 进行计算[16]:SDAI = SJC28 + TJC28+ PhGA +PGA+CRP (PGA、PhGA:VAS 0~10 cm),使用的 SDAI 分组标准: SDAI 分值≤11 分定义为低疾病活动组;SDAI 分值处于 11~26 分时为中度活动组;SDAI 分值>26 分时定义为重度活动组。CDAI 计算采用 Zhu 等[18]的方法:CDAI=SJC28 + TJC28+PhGA +PGA(PGA、PhGA:VAS 0~10 cm),使用的 CDAI 分组标准:CDAI 分值≤10 分为低疾病活动组;CDAI 分值 10~22 分时称为中度活动组;当 CDAI 分值>22 分定义为重度活动组。表 4 RA 患者关节 DAS28 评分表Tab4 Joint evaluation of DAS28 in RA patients左 右 一、 关节压痛评价:压痛 肿胀 压痛 肿胀 0=无压痛;肩关节 1=轻度压痛,在关节边缘或触及韧带时重压,病人称有压痛, 但被动活动不受限;肘关节腕关节 2=中度压痛,重压病人称有压痛,见皱眉表示不适,被动活动近 端 指 间 1轻度受限;关节(PIP) 3=重度压痛,重压有压痛,且退缩逃避,被动活动严重受限。


 二、 关节肿胀评价:
安徽医科大学硕士学位论文4 0=无肿胀;5  1=软组织肿胀;2=在 1级以上伴关节积液。掌 指 关 节 1三、 计算:(MCP) 2 压痛关节数:压痛关节指数:
 
肿胀关节数:肿胀关节指数:膝关节肿胀关节数: 关节肿胀指数:疼痛关节数: 关节疼痛指数:

2.4 健康评估问卷评分(HAQ评分):
每项得分:0.无困难;1.有些困难;2.很困难;3.不能进行。穿衣,系鞋带和纽扣? 梳头?椅子上无支撑站起? 上床、起床?举杯饮水? 切菜?开瓶塞? 在户外平地上行走?五节楼梯? 洗澡后擦干?弯腰拾起地上的东西? 深受摘下衣架上的衣帽?开关水龙头? 上下车?逛商店? 做家务事如打扫卫生?步行 2000米? 参加喜爱的活动?HAQ评分:总分/20(最高分3.0分)2.5 双手 X线分期及 Sharp评分:实验中所记录的Sharp评分是经由2名放射科专业医师对RA患者双手X线摄片后进行评测所得。Sharp评分[19]通过对双手X线摄片进行定量分析,是国际公认较敏感的评判骨侵蚀的评分。Sharp评分评判10个掌指关节及10个近指关节的骨侵蚀程度和关节间隙狭窄情况,及每块腕骨7个区域的骨侵蚀程度和8个区域的关节间
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隙狭窄情况,见图1、图2。0-4分评判关节间隙狭窄程度,0-5分评判关节骨侵蚀程度。图 1 Sharp 评分中关节间隙评价 图 2 Sharp评分中骨侵蚀评价Fig 1 Evaluation of Joint space narrowing Fig 2 Evaluation of bone erosion手关节狭窄评分标准(18对关节间隙)0分 正常1分 部分狭窄2分 普遍狭窄,有>50%原有关节间隙留存3分 普遍狭窄,<50%原有关节间隙留存或关节半脱位4分 关节强直或关节脱位手关节骨侵蚀评分标准(17对关节或骨)0分 正常1分 散在的骨皮质破坏侵蚀2分 <50%的任何一侧关节面的侵蚀3分 >50%的任何一侧关节面的侵蚀5分 关节完全侵蚀破坏每个关节两侧关节面的骨侵蚀评分总和最多计为5分。关节间隙狭窄总分范围是0-144,骨侵蚀是0-170,相加后的Sharp评分范围为0-314。


2.6 血清内脂素和抵抗素水平测定
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2.6.1试剂盒
受试者血清内脂素和抵抗素水平的测定选用天津市协和医药科技集团有限公司所生产的人内脂素和抵抗素 ELISA 试剂盒。
2.6.2实验标本处理
采集血标本后,在 37℃室温条件下静置 10至 20分钟,待其自然凝固。高速离心机(3000 转/分)离心 20 分钟,离心结束后仔细收集标本上清。采集实验标本后应尽快离心,防止标本变质,标本保存过程中若意外发生样本沉淀的情况,需再次进行离心后方可进行下一步实验,提取样品程序严格按照说明书步骤进行,出现暂时无法立即进行离心的情况时需要将标本冻存在-80℃冰箱中,待下次有条件时取出解冻并尽快完成离心操作,最大程度避免反复冻融标本,减少标本损坏防止影响后续实验结果。
2.6.3实验原理
用经过纯化的人内脂素或抵抗素抗体对微孔板进行包被,从而制成固相抗体,操作时把待测样本加入实验孔中,血清样本中的内脂素或抵抗素能与辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)标记的相应抗体进行互相交联反应,产生目标抗体-抗原-酶标抗体复合物,用洗涤液充分清洗干净之后加入底物 TMB。HRP酶作用条件下催化 TMB 使之变成蓝色,尔后在加入酸后变为黄色。实验孔中最终显示黄色的深浅程度与样本中内脂素或抵抗素浓度正相关。在波长为 450nm 的光下用酶标仪测定各个实验孔的吸光度即 OD 值,首先生成计算标准曲线及标准曲线的方程,再依据标准曲线获得所求样品中内脂素和抵抗素浓度数值。

2.6.4实验步骤
血清内脂素和抵抗素水平的测定:严格按照试剂盒中所附的操作说明进行实验,并且避免因实验时间过长而导致的实验环境温度改变、样本污染,详细操作步骤如下:1) 标准孔的处理:在酶标包被板上选取 10孔作为绘制标准曲线所需的标准孔,第 1、第 2孔中加入标准品 100ul,后在第 1、第 2孔中加入标准品稀释液50ul,混匀;后从第 1、第 2孔中各取出 100ul加入至第 3、第 4孔,于第3、第 4孔中各加入标准品稀释液 50ul,混匀;后在第 3、第 4孔中各取出
 
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50ul弃掉,再各取出 50ul分别加入第 5、第 6孔中,第 5、第 6孔中分别加入标准品稀释液 50ul,混匀;随后从第 5、第 6孔中各取出 50ul加入第7、第 8孔中,再在第 7、第 8孔各加标准品稀释液 50ul,混匀;之后从第7、第 8孔中各取出 50ul加入第 9、第 10孔中,再在第 9、第 10孔中分别加入标准品稀释液 50ul,混匀后从第 9、第 10孔中各取出 50ul弃掉。2) 加样:选取 1 孔作为空白孔(其中不加入样品或试剂,仅仅作为对照,其余操作同其他实验孔相同)、待测样品实验孔。待测样品实验孔中加入样品稀释液 40ul,再在实验孔底部加入待测样品 10ul,使样品浓度稀释 5倍,操作时注意不要触碰孔壁,减少误差,加样步骤结束后轻摇酶标包被板,使液体充分混匀。3) 加酶:分别向各实验孔中加入酶标试剂 50ul,除外空白孔。4) 温育:用封板膜封板,随后 37℃恒温放置 30分钟。5) 配液:用蒸馏水稀释浓缩洗涤液 30倍后,为下一步洗涤备用。6) 洗涤:揭开封板膜,将孔中液体弃去后甩干,每个实验孔中加入配置好的洗涤液,静置 30秒,后弃去洗涤液,重复整个洗涤操作一共 5次,最后拍干。7) 显色:向各个实验孔内先后添加显色剂 A 50ul、显色剂 B 50ul,小心震荡混匀, 37℃避光静置 10 分钟,让反应充分进行,使显色完全。8) 终止反应:向各个实验孔中加入终止液 50ul,及时停止反应。9) 结果测定:将空白孔作为基准在酶标仪上进行调零,波长 450nm 条件下对各个实验孔逐步进行 OD 值的测量。测定过程全部在加入终止液后的 15分钟内完成。

2.6.5 结果判断
标准曲线绘制:本实验使用计算机软件(Excel软件)进行绘制,将横坐标设置为标准物的浓度,纵坐标设置为标准孔各孔测得的OD值,在Excel中绘出此实验条件下血清内脂素浓度-OD值以及血清抵抗素浓度-OD值的2条标准曲线,同时应用Excel软件计算出该标准曲线的回归方程式。待测样品浓度计算:依据各个实验孔在酶标仪下测得样品的OD值,分别带入18安徽医科大学硕士学位论文标准曲线的回归方程式,利用Excel软件计算出样品稀释后的浓度,最后乘以5倍稀释倍数,此时所得数值即为待测样品的初始浓度。
2.7 统计学方法
本研究的统计分析使用到 SPSS 26.0 软件及 GraphPad Prism 8.02软件。其中正态分布计量资料通常采用x±s表示,当数据资料出现非正态分布情况时,用中位数(第 25 位百分数~第 75 位百分数)[M(P25-P75)]表示。采用 t 检验(方差不齐时采用非参数检验)对两组间计量资料进行比较,运用非参数检验对多组间计量资料进行比较,χ2 检验的方法可运用在对各组间率的比较。多元回归分析时采用Logistic regression 分析,相关分析时采用 Spearman 相关分析,定义 P<0.05为差异有统计学意义
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