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基于 LPS 诱导的细胞炎症模型探究中药 活性成分配伍规律

发布时间:2022-08-10 14:38
1.1 中草药在炎症疾病中的研究进展
1.1.1 炎症介导的疾病
炎症反应是一个复杂的生理过程,其功能是通过分泌各种炎症介质和募集免疫细胞来对抗外部病原体,重塑受损组织。各种致病因素,包括感染、组织损伤或心肌梗塞均可诱发炎症,在组织水平上,炎症的特征是肿胀、发红、发热、疼痛和局部功能的丧失[3]。根据炎症持续的时间,可将其分为急性炎症和慢性炎症,手术干预、组织损伤和微生物入侵都会引发急性炎症,急性炎症对组织修复是有利且至关重要的,该过程发生的主要微循环包括血管通透性增加、白细胞激活和迁移以及炎症介质的释放。当破坏性刺激持续存在或炎症反应过度无法消退时,会转化为对宿主有害的慢性炎症。炎症介质主要包括细胞因子以及和炎症相关的酶,细胞因子主要由免疫细胞产生,包括白细胞介素(ILs, Interleukins)、干扰素(IFNs, Interferons)和肿瘤坏死因子(TNFs, Tumor necrosis factors)等,主要用于将白细胞募集到感染或损伤部位,调节感染或炎症的免疫反应,并通过复杂的相互作用网络调节炎症本身。然而,过度的炎性细胞因子的产生会导致组织损伤、血流动力学变化,甚至导致器官衰竭。除了细胞因子,某些酶的异常激活,在心血管和癌症等炎症相关疾病的发展中也发挥着关键作用,如高迁移率族蛋白 B1(HMGB1, High mobility groupbox 1 protein)、超氧化物歧化酶(SOD, Superoxide dismutase)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS, Inducible nitric oxide synthase)和环氧合酶-2(COX-2, Cyclooxygenase2)等,且与炎症相关的酶已被用作医学中的炎症、感染和创伤后的生物标志物。早在 1981 年就有研究表明,氮氧化物的产生与炎症有关,患有腹泻和发烧者尿中硝酸盐排泄量会显著增加[4]。一氧化氮(NO, Nitric oxide)作为最简单的含氮氧分子,可由一氧化氮合酶(NOS, Nitric oxide synthase)对 L-精氨酸(L-Arg)
 
浙江大学硕士学位论文 第一章 绪论
的 NADPH 依 赖 性 氧 化 产 生 ,NOS 可 分 为 原 生 型 一 氧 化 氮 合 酶 (cNOS,Constitutive nitric oxide synthase)和 iNOS。cNOS 又有两个亚型,分别为内皮细胞和神经元表达的内皮型(eNOS, Endothelial nitric oxide synthase)和神经元型(nNOS, Neuronal nitric oxide synthase)[5],它们在钙离子或钙调蛋白的生理控制下产生低水平的 NO,能够调节血管张力、参与神经功能并发挥抗炎作用[6],对机体是有益的。而 iNOS 不是钙依赖性的,能够在各种细胞中表达,如巨噬细胞和肝细胞等,产生的 NO 含量远高于 eNOS 和 nNOS。高水平的 NO 持续产生对机体是有害的,它们可以介导广泛的生理和病理效应,如促进炎症、细胞毒性、组织损伤和慢性疾病等[5]。NO 不同的生理作用可能是由于该分子的多细胞作用、产生水平、部位以及释放到的氧化还原环境,因此,NOS 的诱导和抑制之间的平衡可能是炎症的许多生理学和病理学的基础,而 NO 指标在炎症过程中至关重要。长期以来,炎症一直被认为是导致疾病的主要原因。在许多器官系统中观察到急性和慢性炎症介导的组织损伤,包括心脏、肝脏、脑等[7],长期的器官炎症积累,会引发一系列的疾病如心血管疾病(冠心病、动脉粥样硬化等)、脑部疾病(脑炎等)、呼吸道疾病(肺炎等)、消化道疾病(肠炎)等等,甚至还会导致癌症的发生,据统计,约有 15%的癌症与慢性感染和炎症有关[8]。由于炎症伴随着许多疾病的发生,许多疾病在发展过程中也伴随着炎症的产生,因此,在临床上,抗炎药物的应用十分普遍,成为除抗感染药物以外的第 2 大类常用药[9]。抗炎药物的种类也十分广泛,大致可分为非甾体抗炎药(NSAIDs, Nonsteroidalantiinflammatory drugs)、甾体抗炎药(SAIDs, Steroidal antiinflammatory drugs)和中药[9]。NSAIDs 是 世 界 上 最 常 用 的 药 物 之 一 ,NSAIDs 对 环 氧 合 酶 (COX,Cyclooxygenase)活性的抑制是其发挥抗炎作用的主要原因[10]。目前临床上常用的抑制 COX-2 的 NSAIDs 包括塞来昔布、罗非昔布等。然而,服用 NSAIDs 会导致胃肠道并发症[11],例如胃溃疡和出血,甚至会恶化成为危及生命的疾病。SAIDs 主要为糖皮质激素类药物[9],如地塞米松、氢化可的松、泼尼松等,能够
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浙江大学硕士学位论文 第一章 绪论
影响糖和蛋白的代谢,发挥抗炎和免疫抑制的作用。长期服用 SAIDs 类药物容易诱发或加重感染,并且产生一些不良反应,如消化系统疾病、精神失常、骨质疏松等,因此,甾体类抗炎药在治疗严重疾病时才会作为首选药物,并且,具有精病或癫痫病病史的患者要禁用。传统中药中存在多种生物活性物质,如皂苷、黄酮、生物碱、多糖等[12],其中,许多成分具有多靶点活性,能够通过抑制炎症通路以及炎性细胞因子、NO等介质的产生,从而发挥抗炎的药理作用。且中药活性成分在炎症性疾病的治疗、癌症的预防和治疗中的应用也越来越受到关注。
1.1.2 中草药及其活性成分在炎症性疾病中的应用
中草药在我国被广泛使用,是治疗疾病的有力方法。自发现来源于青蒿的天然成分青蒿素能够抑制疟疾以来,中草药中天然活性化合物的提取和研究,越来越受到医药研究人员的关注。证据表明,天然提取得到的化合物具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗增殖和促细胞凋亡等多种药理作用[13],因此,它们具有作为心血管疾病、哮喘、癌症、神经系统疾病等相关疾病治疗剂的潜力。心 血管 疾病 : 心 血 管疾 病 发 病率居 全 球首 位[14], 动脉粥样 硬化 (AS,Atherosclerosis)是心血管疾病的主要原因,是一种以巨噬细胞炎症为关键过程的慢性炎症性疾病。丹参素是丹参水提物的主要成分,u[15]等人研究表明,丹参素能够显著降低血栓重量、血液黏度,通过抑制 COX-2 的表达,发挥抗血栓和抗血小板凝集的作用。流行病学研究表明,较高类黄酮的摄入与降低心血管疾病发生的风险有关[16]。柑橘皮及其成分具有良好的改善心血管疾病的作用,橙皮苷能够在体内外抑制由胶原、花生四烯酸等诱导的大鼠血小板凝集[17]。此外,中药复方制剂麝香通心滴丸(STDP)含有麝香、蟾酥、丹参、人参总皂苷等多种药材,主要用于治疗冠心病,Xiong[18]等人报道了 STDP 可减轻小鼠动脉粥样硬化病变,减少脂质沉积、纤维化和氧化应激,升高了高密度脂蛋白(HDL, High-density
lipoprotein)水平,还降低了包括 IL-2、IL-6、TNF-α 和 IFN-γ 在内的促炎细胞因子水平。
 
浙江大学硕士学位论文 第一章 绪论
哮喘:哮喘是一种气道慢性炎症性疾病,可导致非特异性支气管高反应性和气流阻塞,核转录因子 κB(NF-κB, Nuclear factor kappa-B)的持续激活与哮喘有关,尤其是在不受控制的重度和中度哮喘患者中[19]。用于治疗哮喘的中草药众多,如小青龙汤、定喘汤、参麦注射液和穿心莲内酯等Bao[20]等人研究表明,穿心莲的活性成分穿心莲内酯能够减弱卵清蛋白(OVA, Ovalbumin)诱导的小鼠肺组织嗜酸性粒细胞增多、气道粘液产生以及 iNOS 的 mRNA 表达,通过抑制 NF-κB通路对 IKK-β 的激活从而减轻哮喘。辅助治疗癌症:大量研究表明,在癌症治疗中,中草药作为放化疗治疗的辅助药物,可有效提高放化疗的敏感性,提高机体的免疫系统功能,减少放化疗引起的副作用和并发症。据报道,人参及其主要成分能够辅助增强癌症(如胃癌、肝癌和胰腺癌等)常规放化疗的疗效,降低复发风险,并改善患者的生活质量,与不服用人参的患者相比,服用人参的患者癌症复发的风险降低了 50%[21]。人参中的人参皂苷 Rg3 被认为可增强免疫反应,并对包括非小细胞肺癌(NSCLC,Non-small-cell carcinoma)在内的大多数癌症具有抗癌活性。一项体外研究表明[22],人参皂苷 Rg3 可能是一种针对 NSCLC 中靶向程序性死亡配体 1(PD-L1,Programmed cell death-Ligand 1)的新药物。临床试验也表明,人参皂苷 Rg3 联合常规化疗可以延长晚期 NSCLC 患者的生存期,改善症状并减少化疗副作用[23]。
1.1.3 9 味中草药的化学成分及抗炎活性研究进展
新型冠状病毒肺炎(COVID-19, Corona Virus Disease 2019)是 2019 年底爆发的由严重急性呼吸综合征冠状病毒 2(SARS-CoV-2, Severe acute respiratorysyndrome coronavirus-2)引起的呼吸道传染病,至今已有两年之久,其症状多样,最常见的是发烧、咳嗽、呼吸困难。在疾病发展过中部分患者由于炎症反应导致病情加重,出现急性呼吸窘迫综合征、脓毒症及多器官功能衰竭等严重并发症[24],而中医药在此次疫情防控过程中发挥了积极作用,包括缓解症状、延缓疾病进展、提高治愈率和降低死亡率,国家卫健委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》自第三版以来推荐中医药治疗 
浙江大学硕士学位论文 第一章 绪论柴胡、陈皮、赤芍、生姜、甘草、牛蒡子、厚朴、连翘和金银花是 9 味在抗炎方面具有非常显著疗效的中药(图 1.1),且在针对 COVID-19 提出的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》第九版推荐的中药方剂中均有所提及,下面,对 9 味药材的主要化学成分和抗炎药理作用研究进展作一简要概括。柴胡:植物柴胡为伞形科植物,中药柴胡是北柴胡 Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡 Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根,最早记载于《神农本草经》,列为上品[25]。随着化学分离、分析技术的发展,中草药的成分得到了进一步的明确,柴胡中含有多种成分,包括皂苷类、挥发油、多糖、黄酮以及微量元素等。皂苷类成分是柴胡的标志性和主要生物活性成分。现代药理研究表明,柴胡及其活性成分具有抗炎[26]、解热镇痛、抗病毒、保肝利胆、抗癫痫、抗抑郁、神经保护等多种活性。柴胡已被证明能显著抑制由角叉菜胶引起的大鼠足部肿胀,胡
中的柴胡皂苷类成分对炎症过程具有抑制活性,包括炎症渗出、毛细管通透性增
 
浙江大学硕士学位论文 第一章 绪论
加、炎症介质释放和各种过敏性炎症[27]。柴胡皂苷 a 和 d 能够通过抑制炎症介质和内源性糖皮质激素的释放发挥抗炎作用[28]。柴胡皂苷 b2 能够通过干扰 IKKβ 和IκBα 活化有效抑制脂多糖(LPS, Lipopolysaccharide)诱导的促炎介质的释放,从而阻止 NF-κB 的激活[29]。陈皮:陈皮为芸香科植物橘橘 Citrus reticulata Blanco 及其栽培变种的干燥成熟果皮,可分为“陈皮”和“广陈皮”。广陈皮为橘的栽培变种茶枝柑或四会柑的干燥成熟果皮,由于茶枝柑是广陈皮的主要来源且产自中国广东省新会区,因此,称之为新会陈皮[30],不同产地的陈皮药理作用无较大差异。迄今为止,已从陈皮中分离鉴定出约 140 种化学成分,包括黄酮类、生物碱和挥发油,此外,还包括少量微量元素、维生素、果胶和多糖等,黄酮类化合物被认为是其主要生物活性成分和特征成分[31]。多甲氧基黄酮是柑橘类植物中独有的黄酮类化合物[32],且含有丰富的生物活性化合物,如川陈皮素、橘皮素等。整体而言,陈皮及其提取物具有丰富的药理活性,包括对心血管系统的影响、对消化系统的影响、对呼吸系统的影响、肝脏保护、抗癌、抗炎、抗氧化和神经保护等[31]。陈皮具有强大的抗炎作用,通过减少促炎细胞因子如 NO、TNF-α、IL-1β 和IL-6 的分泌来介导炎症,能够通过抑制 iNOS 和 COX-2 基因的表达,减少 LPS 诱导的巨噬细胞 RAW264.7 和小胶质细胞中 NO 的产生,其强大的抗炎能力归因于活性成分川陈皮素、橙皮苷、柚皮素和橘皮素的共同作用[33,34]。川陈皮素还具有改善实验性结肠炎的能力,Xiong[35]等人体内外研究表明,川陈皮素降低了大鼠上皮促炎细胞因子和介质的产生,通过抑制蛋白激酶 B(Akt, Protein kinase B)、NF-κB、肌球蛋白轻链激酶(MLCK, Myosin light-chain kinase 2)的表达恢复结肠炎大鼠受损的屏障功能。赤芍:赤芍为毛茛科植物芍药 Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍 Paeonia veitchiiLynch 的干燥根,具有清热凉血、散瘀止痛的功效。现代药物化学和药理研究表明,赤芍中主要包含单萜苷类、鞣质类及黄酮类化合物,具有保肝、神经保护、抗炎、抗血栓、抗肿瘤等多种药理活性。
 
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赤芍对心血管疾病的治疗非常显著,在急性心肌梗死大鼠模型中,赤芍提取物在调节心肌酶、细胞因子、氧化应激、凝血和细胞凋亡方面发挥了积极作用[36]。NO 在心血管、免疫和神经系统中起着重要的调节作用,芍药苷可通过抑制炎症和 iNOS 信号通路来改善大鼠心肌梗死[37]。Liu[38]等人实验研究表明,芍药苷可减轻心脏纤维化和缓解炎症,改善左心室功能,此外,芍药苷可降低血压并增加血流动力学指标,并且对心脏的保护作用与抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK,Mitogen-activated protein kinase)信号通路有关。生姜:生姜为姜科植物姜 Zingiber officinale Rosc.的新鲜根茎,其使用可以追溯到《神农本草经》[39],既是一种具有悠久历史并且广泛使用的中药,也是民间常用的食材。中医多用于治疗风寒感冒、呕吐、咳嗽等,并以止吐作用闻名。随着对其药理作用深入研究,发现生姜具有广泛的生物活性,包括抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、抗肥胖、抗糖尿病、止吐、抗过敏、神经保护、保肝和呼吸保护等多种功能[40],植物化学也使得生姜的化学成分和药效物质基础得到进一步明确,生姜中目前已发现有 100 多种化合物,主要可分为挥发油、姜辣素、二苯基庚烷三大类[40],其中,6-姜酚和 8-姜酚含量最多[41]。研究表明,生姜及其活性成分具有显著抗炎活性,等相关疾病[42]。6-姜烯酚能够通过影响 PI3K/Akt 和 NF-κB 相关的信号通路,显示出对肠屏障功能的保护作用[43]。生姜还可抑制COX-2并减少炎症因子的产生[44]。另一项研究提到生姜能够降低糖尿病患者的 TNF-α 和超敏 C 反应蛋白(hs-CRP,hypersensitive C-reactive protein)水平[45]。老年人群中,患神经退行性疾病的风险很高,如阿尔兹海默症和帕金森病,许多研究表明[46,47],来自生姜中的化合物如6-姜烯酚、10-姜酚等对记忆功能有积极的影响,能够通过抑制小胶质细胞中的促炎因子的产生以及 mRNA 水平,发挥抗神经炎症活性。甘草:药材甘草为豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草 Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎,具有清热解毒、补脾益气以及调和诸药的功效,临床应用范围广。中医广泛用于治疗肝炎、
 
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流感、咳嗽和胃溃疡,除此之外,甘草也具有重要的经济价值,其提取物已被用于化妆品、食品配料、烟草香精和功能性食品中[48]。根据现代化学和药理学研究,甘草中最重要的生物活性化合物为皂苷、黄酮和多糖,如芒柄花素、甘草素和甘草酸等,它们具有抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗菌、保肝和免疫调节等[49]多种药理功能。甘草已被广泛用于治疗胃溃疡、口腔溃疡和溃疡性结肠炎,通过改善结肠粘膜微观结构,提高 SOD 水平,发挥治疗溃疡性结肠炎作用,此外,炎性细胞因子TNF-α、NO和 IL-6水平也能够呈剂量依赖性降低,甘草提取物对乙酸诱导的溃疡性结肠炎的治疗具有重要意义,这可能是由于甘草抗氧化和抗炎特性[50]。杨晓露[51]等人考察了甘草不同提取部位的抗炎活性,发现乙酸乙酯提取部位对 IFN-γ 和LPS 诱导的巨噬细胞 RAW264.7 上清液中亚硝酸盐的含量抑制效果最好,进一步乙酸乙酯部位进行分离,富集得到甘草总黄酮能够呈剂量依赖性的抑制细胞上
清液中亚硝酸盐的生成且效果优于乙酸乙酯提取物,该研究还发现甘草黄酮类化合物异甘草素能够显著抑制 iNOS、COX-2 基因、IL-1β 以及 IL-6 的表达,以及提高 过 氧 化 物 酶 增 殖 物 激 活 受 体-γ(PPAR-γ, peroxisome proliferators-activatedreceptor-γ)的表达,表明异甘草素可能是甘草总黄酮发挥抗炎作用的活性化合物。牛蒡子:牛蒡子又称“恶实”、“大力子”,为菊科牛蒡属植物牛蒡 Arctiumlappa L.的干燥成熟果实,具有疏散风热,宣肺透疹之功效,是中医临床常用的辛凉解表药,主要用于治疗风热感冒、咳嗽痰多、咽喉肿痛和麻疹等。其化学成分主要包括木脂素类、挥发油、脂肪酸、倍半萜和三萜类等,具有抗炎、抗肿瘤、抗糖尿病、抗病毒等药理作用。牛蒡苷和牛蒡子苷元为木脂素类化合物,虽然牛蒡苷在牛蒡子中的含量最多,但牛蒡子苷元却被报道为牛蒡子中最有效的生物活性成分[52],也有研究表明[53,54],牛蒡苷和牛蒡子苷元在肝脏、肠道和血浆中存在葡萄糖醛化和水解反应,这可能会阻碍其口服给药后的体内和临床疗效。多项研究表明,牛蒡子的抗炎活性归因于木质素类成分,关于牛蒡苷抗炎作用的研究很少,而牛蒡子苷元是其中抗炎效果最显著的化合物[55]。其抗炎作用在
 
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各种炎症性疾病模型中均得到证实,包括局部水肿、结肠炎、急性肺损伤和脑外伤等,牛蒡子苷元可有效缓解各种刺激引起的大鼠局部组织炎症的扭体反应、毛细血管通透性增强和水肿体积等症状[52],其抗炎作用首先被证明是通过在活性水平上抑制 iNOS 从而抑制 NO 产生来介导的,还能够通过抑制 MAPK 和血红素氧合酶 1(HO-1, Heme oxygenase-1)等信号传导发挥急性肺损伤的保护作用[56]。此外,牛蒡子苷元还能减少白细胞向局部组织的浸润,这是急性炎症的典型标志。厚朴:中药厚朴为木兰科植物厚朴 Magnolia officinalis Rehd. et Wils.或凹叶厚朴 Magnolia officinalis Rehd. et Wils. var. biloba Rehd. et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮。《中国药典》中记载的藿香正气丸、木香顺气丸、保济丸、香砂养胃丸等也将厚朴作为君药使用,具有燥湿消痰,下气除满的功效,其主要化学成分可分为木脂素、挥发油和生物碱。现代药理研究表明,厚朴具有对消化系统、神经系统和心脑血管系统的作用,以及抗菌、抗肿瘤、镇痛、抗炎和抗氧化等广泛活性。厚朴酚与和厚朴酚为联苯型新木脂素,互为同分异构体,是厚朴中含量最多的有效成分。厚朴提取物已经被证实具有一定的抗炎活性,从厚朴中分离的许多化合物也被证明可以改善炎症反应,如厚朴酚与和厚朴酚能够明显缓解福尔马林诱导的小鼠炎症性疼痛,且无运动或认知副作用[57]。厚朴中分离得到的单体 4-O-甲基和厚朴酚也能够通过抑制 NF-κB 显示出抗炎特性[58],和厚朴新酚通过抑制 NF-κB 和MAPK 途径抑制 NO 生成[59]。有研究表明,厚朴酚与和厚朴酚对脑缺血、缺氧和缺糖再灌注造成的神经损伤具有保护作用,该作用可能与其抗氧化(清除 ROS 活性氧)、抗炎(包括 NO、TNF-α 和抑制 NF-kB 活化)和改善血脑屏障功能有关[60]。连翘:药材连翘是木犀科植物连翘 Forsythia suspensa (Thunb.)Vahl 的干燥果实,根据采收时期的不同有“青翘”和“老翘”之分,具有清热解毒、消肿散结、散风热的功效[61],作为一种传统中药,中医临床上常用于治疗炎症、发热和感染性疾病[62]。虽然只有连翘果实被用作中药,但其叶子、花和种子的植物化学和药理作用也有相关研究报道[63,64]。迄今为止,已从连翘中提取到三百多种成分[65],
 
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包括苯乙醇苷、木脂素、酚酸类等,其中苯乙醇苷和木脂素被认为是其特征和活性成分。现代药理研究表明,连翘及其提取物具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗呕吐、抗肿瘤等作用,并具有保肝、保护神经、保护心血管等作用[66]。连翘的抗炎作用是其最常见的临床用途,其抗炎活性在 81 种受测中药(70%乙醇提取物)中排名前五[67]。研究发现,连翘的乙醇、甲醇和水提取物在体内外均表现出显著的抗炎作用[66]。此外,其挥发油通过抑制前列腺素 E2(PGE2,Prostaglandin E2)、组胺和血清素的释放,在小鼠耳肿胀、小鼠腹腔毛细血管通透性、大鼠足肿胀、大鼠后足水肿、油酸刺激的急性肺损伤和大鼠棉球肉芽肿模型中显示出抗炎作用[68]。来自连翘的苯乙醇苷类化合物连翘酯苷 A 具有显著的抗炎活性,通过影响 NF-κB、MAPK 和 Nrf2/HO-1 信号通路,降低 LPS 刺激的 BV2 小胶质细胞、RAW264.7 细胞、人支气管上皮细胞(BEAS-2B)、急性小鼠肝损伤模型和肺损伤模型中的促炎介质水平,包括 TNF-α、IL-1β、NO和 PGE2[66]。并且,连翘水提物可抑制 B16-F10 黑色素瘤移植 C57BL/6 小鼠癌细胞增殖和血管生成,延长荷瘤小鼠的存活时间,显示出明显的抗肿瘤活性,其抗肿瘤作用涉及减少肿瘤内的氧化应激和炎症,这与连翘的清热解毒作用密切相关[69]。金银花:金银花为忍冬科植物忍冬 Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花。其味甘,性寒,具有清热解毒、疏散风热的功效,在传统中医中,金银花广泛用于治疗各种疾病,包括发烧、咳嗽、咽喉痛、流感感染和关节炎。现代药理学研究表明金银花及其主要化合物具有抗炎解热、抗病毒、抗氧化、降血糖、抗肿瘤、保肝以及对 COVID-19 的潜在治疗效果,主要成分包括酚酸类、黄酮类、环烯醚萜苷和三萜皂苷类。炎症反应往往伴随着发热,金银花提取物能够有效降低炎性介质 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的表达,减轻 LPS 引起的大鼠发热。木犀草素是木犀草苷的苷元形式,二者均为金银花中的成分,李慧香[70]等人研究发现,木犀草苷及其苷元均具有一定的抗炎活性,二者均能够显著抑制醋酸致小鼠腹腔毛细管通透性增加以及 LPS诱导的小鼠巨噬细胞 RAW264.7 细胞产生的炎性介质,但木犀草素的抗炎活性优
 
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于木犀草苷,且木犀草素能够改善角叉菜胶所致大鼠足跖肿胀,而木犀草苷未显示出抑制效果。王伟[71]等人也证明了木犀草素抑制细胞中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β的 mRNA 相对表达量优于木犀草苷。
1.1.4 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞炎症模型
用于中药提取物及其化合物抗炎活性研究的模型,根据炎症进程可分为急性炎症模型、亚急性炎症模型和慢性炎症模型[72];根据研究对象的不同,可分为体内和体外炎症模型,体内模型一般以动物(如:小鼠、大鼠和斑马鱼等)为研究,通过致炎介质(角叉菜胶、二甲苯、冰醋酸等)的刺激导致炎症的发生从而建立的炎症模型,包括足肿胀、耳肿胀、毛细管通透性增高、肉芽肿炎症模型。体外炎症模型是在细胞水平上,以促炎介质诱导巨噬细胞释放大量炎性细胞因子所建立的炎症模型,LPS 和 RAW264.7 细胞分别为常用的促炎因子和巨噬细胞系,本节将重点介绍两者与炎症的关系。

1.1.4.1 LPS 介导的炎症反应机制
LPS 是革兰氏阴性菌外膜的主要成分[2](图 1.2 a),由三部分组成(图 1.2 b),分别为脂质 A、核心多糖和可变长度的 O-特异性链(可连接单糖单元)。脂质 A结构是 LPS 的生物活性组成,O-特异性链的组成在不同革兰氏阴性菌菌株之间有所不用(图 1.2 c),菌落的“平滑”与“粗糙”通常指示 O-特异性链糖基化的程度,长的 O-特异性链形成光滑的菌落,而缺乏 O-特异性链则形成粗糙的菌落[73]。Toll 样受体 4(TLR4, Toll-like receptor 4)是哺乳动物经 LPS 刺激后的传导受体 ,LPS 参 与 的 信 号 传 导 机 制 如 图 1.3 所 示[1],LPS 结 合 蛋 白 (LBP,Lipopolysaccharide binding protein)与 LPS 结合后,导致 LPS 聚集体被破坏,从而与靶细胞(内皮细胞、单核细胞和巨噬细胞)表面的白细胞分化抗原(CD14,Cluster of differentiation 14)结合形成 LPS-LBP-CD14 复合物。髓样分化蛋白 2(MD-2, Myeloid differentiation protein-2)能够与 TLR4 胞外结构域结合,LPS-
LBP-CD14 复合物与 MD-2-TLR4 复合体作用,激活胞内 TIR 结构域,触发信号级联反应。髓样分化蛋白 88(MyD88, Myeloid differentiation protein 88)和 MAL
 
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图 1.2 LPS 在革兰氏阴性菌细胞膜表面示意图及其结构[2](c 图:R 表示粗糙型脂多糖;SR 表示只连接有一个 O-特异性链的半粗糙型脂多糖;S 表示光滑型脂多糖)
浙江大学硕士学位论文 第一章 绪论(MyD88-adapter-like)作为桥梁,通过 TRAF6 激活 NF-κB、p38 和 JNK/MAPK信号通路。TLR4 激活的另一个通路涉及 TRAM,TRAM 表示 TRIF 相关的衔接分子,TRIF 是 β-干扰素 TIR 结构域衔接蛋白,TRAM 募集 TRIF 蛋白,该蛋白可激活 TRAF3TRAF6 和受体相互作用蛋白 1(RIP1, Receptor-interacting protein 1),释放促炎因子和趋化因子,从而导致发烧、休克、器官衰竭甚至死亡,LPS 是全身炎症反应的有效诱导剂。

1.1.4.2 巨噬细胞与炎症反应
活化的巨噬细胞是炎症反应中最重要的效应细胞之一,它们是针对病原体和炎症免疫反应的主要介质。此外,巨噬细胞还在维持组织稳态和修复受损组织中起关键作用。为了发挥这些不同的功能,根据组织微环境和外在因素,巨噬细胞具有不同的特征。其大致分为两种功能相反的亚型:包括促炎 M1 型巨噬细胞和抗炎 M2 型巨噬细胞(M2a、M2b 和 M2c 型)[74]。M2 型巨噬细胞由 TH2 细胞因子 IL-4 和 IL-13 诱导分化,能够使炎症消退,具有抗炎作用。M1 型巨噬细胞通常由 I 型细胞因子如 IFN-γ 和 TNF-α 诱导,或在识别病原体相关分子模式(PAMP,Pathogen-associated molecular patterns)如 LPS 后诱导产生,当遇到这些刺激时,巨噬细胞会分泌高水平的 NO、促炎细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β 等)和趋化因子[75],促进炎症过程的发生和巨噬细胞介导的组织损伤。

1.1.5 小结
本小节简要概括了炎症性疾病以及中医药在疾病治疗中发挥的重要作用,对柴胡、陈皮、赤芍、生姜、甘草、牛蒡子、厚朴、连翘和金银花 9 味药材主要化学成分和抗炎药理活性进行了阐述,总结了抗炎模型的分类并对细胞水平的抗炎模型进行了介绍,明确药材潜在的生物活性化合物,为进一步配伍研究提供参考。
1.2 中药配伍研究策略
中药配伍具有多成分、多靶点、多途径联合作用的特点,能够对疾病发挥较好的协同治疗效果,同时允许以较低的药物剂量实现相同甚至更好的治疗效果。
 
浙江大学硕士学位论文 第一章 绪论
图 1.4 中药配伍研究策略Figure 1.4 Research strategy on compatibility of traditional Chinese medicine中药配伍化合物筛选策略如图 1.4 所示,配伍研究分为中药药材配伍和中药有效组分配伍,而有效组分配伍又可分为有效部位配伍和有效成分配伍[76]。1.2.1 中药药材配伍中药药材配伍即为传统的中药方剂,是根据中医辨证论治的指导原则,结合患者的体质、疾病的病症以及当下环境气候等各种因素,选择合适的草药、动物或矿物质混合煎煮,实现驱邪扶正、治疗疾患的功效[77],中药方剂的配伍需要严格按照中医理论指导,而不是简单聚合某些药用植物,“君-臣-佐-使”是最典型、最重要的理论之一,它形象地界定了方剂中各药物的不同作用,在该理论中,“君药”代表方剂中最重要的成分,针对疾病的主症发挥治疗效果。“臣药”是指起辅助治疗作用的药物。“佐药”主要是指与君臣药物配合治疗,或减弱君臣药可能产生的副作用或毒性的药物。“使药”是指具有调和诸药,引导其他成分至病变部
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位的药物。如 1800 年前张仲景在《伤寒论》中记载的小柴胡汤[78]主治伤寒少阳之症,方中柴胡作为君药,解郁退热、散少阳之邪;黄芩为臣药,清热燥湿;半夏、生姜为佐药,调和胃气、降逆止呕,人参、甘草、大枣为使药,具有益气和中,扶正祛邪之功效[79,80]。即使到了 21 世纪的今天中药方剂仍然在疾病的治疗中占据一定的地位,因为它具有确切的和在长期实践中被证明的疗效[81]。与化学药物相比,中药方剂更容易获得,加工更简单且成本更低。然而,不清楚的化学成分,如活性成分、无效成分和有毒成分分别是什么,不明确的分子机制以及不符合医药现代化“精准治疗”的核心,阻碍了中药方剂在全球的广泛使用。因此,为克服药物质量难以控制、安全性难以保证以及储存不便等缺陷,需要对中药方剂做进一步简化。

1.2.2 中药有效部位配伍
中药有效部位配伍是对单味药材通过水提醇沉等分离手段,将得到的药效部位(如总皂苷、总黄酮)进行配伍,如 2020 年版《中国药典》中收录的小柴胡片、正柴胡饮颗粒[62]等,是中药方剂向现代化过渡的一个重要标志。吴彦[82]等人体外实验表明,麦冬总苷、甘草总黄酮、银杏叶提取物、淫羊藿总黄酮和黄芪总苷 5种中药有效组分配伍后,对于清除多环芳烃和自由基等致癌物质的活性显著强于单味药。周艳丽[83]等人发现,白芍总苷能够降低雷公藤多苷片导致的急性肝损伤小鼠血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量,升高 SOD 水平,降低肝匀浆中丙二醛的含量,从而发挥对肝损伤的保护作用。然而,虽然成分得到了相对简化,但仍存在现有化学成分不明、作用靶点及作用机制不明确的问题,这给在分子水平上阐释配伍理论的科学内涵带来了障碍,限制了其进一步临床应用。例如:中药注射液能够在临床治疗中显示出良好的治疗效果,能够发挥抗病毒和改善心肌缺血等,然而,由于直接注入循环系统的成分未知且复杂,中药注射剂引起了一系列的药物不良反应[81],导致一些有效的中药注射剂被限制和取缔。
 
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1.2.3 中药有效成分配伍
有效成分配伍是指对从中药中提取得到的天然化合物进行药对配伍或多组分配伍[84]。中药有效成分之间的配伍,不仅具有中药方剂增效减毒的优势,而且具有明确的化学成分,易于质量控制;剔除了可能的非活性或有毒物质导致的不确定性,治疗效果可靠、安全性提高[81]。此外,治疗靶点和作用机制也能够进一步从分子水平上得到阐明[85],从而揭示配伍理论的科学内涵,使中药研究真正走向现代化。中药有效成分配伍,不仅成分明确、质量可控,还能发挥中药协同作用的特点,应是未来中医药现代化的重要方向。中药有效成分筛选模式根据来源可分为以下几种形式:
1.2.3.1 基于中药经典方剂筛选有效成分

中药经典方剂在长期的实践中已经显示出了良好的治疗效果,并且含有丰富的潜在活性化合物,因此,可以以临床方剂为基础,但不将方剂作为研究对象,而是对其中单味药的活性成分进行筛选[86],得到能够发挥与复方功能主治相似的药物组合。与经典方剂类似,中药复方制剂也可以作为筛选配伍有效成分的来源,中药复方制剂是在中医辨证论治的原则下,通过现代制药技术开发的新型中药制剂。例如,复方黄黛片由青黛、雄黄、丹参和太子参组成,主要用于治疗急性早幼粒细胞白血病,Wang[87]等人将硫化砷、靛玉红和丹参酮 IIA 确定为该配方的主要活性成分,并进一步阐明了三者的协同分子机制,单用硫化砷可延长急性早幼粒细胞白血病小鼠的存活时间,但与靛玉红和丹参酮 IIA 合用可以增强硫化砷对早幼粒细胞白血病/视黄酸受体 α(PML-RARα)癌蛋白的降解,以及增加负责硫化砷运输和细胞摄取通道蛋白的表达,显著增强治疗效果。李建生[88]等人对金水缓纤方进行了有效成分配伍研究,确定了金水缓纤组分方。金水缓纤原方由 10 种药材组成,该研究选取了 10 种药材活性成分作为候选化合物,通过对补气组、补肾组、活血组等不同功效组进行评价和优化,得到了成分确切、疗效显著的金水缓纤组分方(淫羊藿苷、川陈皮素、贝母素甲、芍药苷、异甘草素)及其最佳配比。16
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1.2.3.2 基于中药经典药对筛选有效成分
药对是两种常用药物的固定药物组合,是中药配伍的基本形式,是古代临床经验的积累。药对的搭配使用往往比单独使用具有更好的效果或更低的毒性[89],来自经典药对的化合物可成为有效成分配伍的候选药物。如经典药对附子-甘草来自张仲景的《伤寒论》,次乌头碱和甘草次酸分别来源于附子和甘草,二者 1:1 合用时,能够显著改善缺氧和葡萄糖缺乏引起的大鼠心肌细胞损伤[90]。1.2.3.3 基于单味中药筛选有效成分即使是单味中药,也含有复杂的化学成分,可将每一味中药看做一个成分库,只不过单味药中各个成分的比例相对固定,然而,不同成分或不同比例的成分配伍,药理活性差异较大,因此,可以对单味中药的不同成分、不同比例进行组合优化,从而达到寻找增效、减毒、扩展疗效的配伍药物的目的[91]。例如:丹酚酸B 和 C 均来源于中药丹参,较单一成分,二者合用(1:1)能够较大程度的改善大鼠肾纤维化作用,其作用机制可能与干扰肾纤维化过程中的趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(CCL2, Monocyte chemotactic protein 1)和巨噬细胞炎症蛋白-3α 的表达有关[92]。郭俊和[93]等人发现来自石菖蒲的化合物β-细辛醚和丁香酚在配伍比例为 3:1 和 5:1 之间时,能够有效改善痴呆小鼠的认知能力,但该配伍比例与两个成分在石菖蒲中的含量比是不同的。因此,单味中药组分配比的研究,是发现治疗疾病的一种新方法、新途径。

1.2.3.4 基于药效部位筛选有效成分
对单味药材采用水提、醇提等提取分离手段,得到具有一定药理活性的单味药材提取物如总黄酮、总皂苷等,仍然含有大量未知化合物,但化学成分相对比较容易识别,成分比例固定,可以通过对其中含有的化合物进行组合研究,从而筛选出药效相似且成分明确的药方[81]。曹浪[94]等人通过酸碱沉淀和离子交换色谱法对中药补阳还五汤中的苷类成分进行了提取、分离,并对分离得到的化合物进行配伍以探究其对血管平滑肌细胞增殖的影响。结果显示,黄芪甲苷、苦杏仁苷和芍药苷三个化合物联合使用显著抑制了血小板衍生生长因子(PDGF, Platelet
 
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derived growth factor)诱导的大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC, Vascular smoothmuscle cell)的周期转换,具有抑制 VSMC 增殖的潜力,且 IC50 低于化合物单用或苷类成分。
1.2.3.5 根据现代药理研究筛选作用明确的中药活性标准物质中药现代化的最大挑战之一是确定具有治疗效果的活性化合物,目前,已经从中药或天然产物中分离出多种具有药理活性的化合物,如青蒿素和三氧化二砷,可以根据疾病的病因对可能产生协同作用的化合物标准物质进行配伍,寻找具有
增效、减毒的最佳配比的药物组合[95]。丹参和葛根具有相似的药理活性,包括抗脑缺血,心肌缺血、保护血管内皮细胞等[96],Gao[97]等人研究表明,丹参酮ⅡA与葛根素 1:1 合用可以改善心脏功能、减少心肌细胞的破坏、抑制心肌纤维化和心室重构来改善血流动力学。缺血性脑卒中,中医称之为“中风”,是指当脑供血不足时,局部脑组织因缺血缺氧引起的神经功能缺损疾病。药物治疗主要包括溶栓、抗血小板聚集、活血化瘀、抗炎和神经保护等。天然活性成分丹皮酚能够降低脑缺血再灌注损伤后大鼠脑组织和血清中炎症细胞因子(TNF-α、IL-1β)的水平,通过减轻局部过度炎症发挥保护作用[98]。木犀草素可以通过干扰 JNK 信号通路和激活小胶质细胞中的激活蛋白-1(AP-1, Activator protein 1)来抑制 LPS 诱导的小鼠大脑中 IL-6 的产生[85],因此,木犀草素可用于减轻神经炎症。芍药苷能显著减少大脑动脉闭塞引起的梗死体积,改善大鼠神经系统功能缺陷[99],并且能够减轻大鼠局部脑缺血再灌注损伤后自由基引起的氧化损伤,从而发挥对神经系统的保护作用[100]。这些化合物在中风的不同环节能起到不同的疗效,因此,有望对其进行药物组合研究,进而确定治疗痛风的最佳配伍比例。

1.2.4 中药配伍发展方向将筛选得到的成分进行组合研究,根据是否符合中医辨证论治的配伍原则,将配伍组分分为两个方向,即组分中药和天然药物[86](如图 1.4)。组分中药表示两种或多种成分的组合符合中医药配伍理论且具有与原药材接浙江大学硕士学位论文 第一章 绪论近的功能主治,或从复方药材中筛选出来,能反映该方功效并符合中医理论的药物组合,这两种情况所组成的药方均归为组分中药。天然药物表示该药物组合是基于高通量筛选或其他现代药理活性评价方法得到的化合物组合,独立于中医药方剂学理论,这种依据现代医药理论筛选而来,更类似于成分明确的天然药物。
1.2.5 小结
本小节概述了中药配伍研究的三个层次,包括药材配伍、药效部位配伍和有点。随后总结了有效成分的筛选策略,主要包括基于中药经典方剂、经典药对、单味中药、药效部位以及根据现代药理挖掘的作用明确的中药活性标准物质进行配伍研究。中药配伍研究策略以有效成分配伍发展现代中药,在保持中医药核心优势的同时,也融合了现代药物的设计技术,是中药新药研发的新模式和新方法。


1.3 药物协同作用及其评价模型
1.3.1 药物协同作用简介
“一种药物、一种靶点、一种疾病”的方法在一段时间内一直是化学药物开发和治疗策略的常规方法。近年来,单一药物的治疗模式逐渐转向联合治疗,特获得了广泛认可。如:世界卫生组织鼓励将青蒿素用于联合治疗[102],虽然它对疟原虫的治愈率高达 95%,但仍然需要预防耐药性。两种或多种药物联合使用对于疾病的治疗是有益的,因为它可以降低药物剂量并因此降低毒性,联合用药的多靶点治疗能够产生协同效应,并大大减少耐药性的产生。Vuuren[102]等人将协同作用定义为:组合使用该药物可以增强疗效、降低毒性、减少副作用、增加生物利用度、降低剂量和减少耐药性。
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